在植物面對不斷變化的環(huán)境中,基因表達調控網(wǎng)絡幾乎參與了所有的過程。轉錄因子是調節(jié)基因表達水平的關鍵,而NAC轉錄因子是植物特有的轉錄因子,能夠參與調控植物多種生物過程。但是有關NAC轉錄因子調控植物激素信號傳導途徑來應答病毒入侵的機制還很不清楚。我們研究了本生煙NbNAC1轉錄因子調控植物激素信號傳導途徑來應答病毒入侵的機制。首先我們通過RT-PCR的方法成功從本生煙中克隆得到NbNAC1的全長序列。系統(tǒng)發(fā)生進化樹構建的結果表明,NbNAC1與抗逆反應相關的轉錄因子番茄S1NAC1和辣椒CaNAC1的親緣關系最近。共定位實驗表明NbNAC1定位于細胞核,酵母單雜交實驗證明了其C端具有轉錄激活活性。熒光定量PCR結果表明,煙草花葉病毒(TMV)侵染本生煙后能夠誘導NbNAC1基因的表達。然后我們利用病毒誘導的基因沉默技術將NbNAC1的表達成功抑制后接種TMV。和對照相比,沉默NbNAC1的植株中病毒大量積累,并且沉默植株中活性氧爆發(fā)。說明抑制NbNAC1的表達,植物的系統(tǒng)性抗性減弱。進一步研究表明,沉默NbNAC1的植株,水楊酸(SA)含量顯著下降,SA合成與信號途徑關鍵酶基因MbICS1、NbNPR1、以及SA介導的防御基因NbPR1、NbPR2、NbPR5的表達顯著下調。之后同時缺失SA和NAC信號,研究植物系統(tǒng)性抗性是否發(fā)生變化。在接種TMV后,同時缺失SA和NAC信號的植株中病毒大量積累,活性氧爆發(fā),植物變得對TMV超級敏感,丙二醛和電導率的結果也表明細胞膜損傷更為嚴重,說明植物的系統(tǒng)性抗性進一步顯著減弱。另外利用水楊酸處理缺失NAC信號的植株,結果顯示可以部分地恢復由于缺失NAC信號所丟失的抗性。因此我們認為,NbNAC1轉錄因子在調控植物系統(tǒng)性抗性防御病毒入侵過程中起重要作用,可能調控SA信號途徑應答病毒入侵。該研究為利用基因工程原理改良農(nóng)作物的抗逆性,培育優(yōu)良品種,增強植物對病原菌的抵抗力提供重要的理論依據(jù)。為了更深入研究轉錄因子NbNAC1在激素信號網(wǎng)絡中作為關鍵調控因子的調控作用,探索NbNAC1與水楊酸信號轉導途徑蛋白質互作模式,有必要通過DNA重組技術獲得NbNAC1重組蛋白并制備血清抗體。原核表達系統(tǒng)能夠便捷高效地獲得目的蛋白,因此構建高效的表達體系是獲得NbNAC1蛋白的關鍵。我們選擇了兩種標簽的表達載體,成功構建了 pET28a-NbNAC1和 pGEX-4T-1-NbNAC1 載體,利用 E coil Rosetta(DE3)菌株進行表達。通過對誘導條件探索,我們發(fā)現(xiàn)兩種載體都是在37℃、1mMIPTG誘導條件下表達量最大。經(jīng)SDS-PAGE電泳檢驗,pGEX-4T-1-NbNAC1載體表達的蛋白是可溶性蛋白,主要集中在上清中可以直接用GST介質純化。而pET28a-NbNAC1載體表達后形成包涵體蛋白,主要集中于沉淀中,我們利用包涵體復性技術,成功制備NbNAC1蛋白。將蛋白乳化處理后,直接對大白兔進行注射,獲得血清抗體,經(jīng)Westernb1ot檢測,獲得的血清抗體具有較高效價,可以用于后續(xù)實驗。本研究探索了兩套解決原核表達包涵體蛋白問題的方案,成功純化出NbNAC1蛋白并制備出血清抗體,為后續(xù)研究NbNAC1與SA互作奠定基礎,也為原核表達體系中包涵體問題的解決提供新的策略。
【學位單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：Q943.2
【部分圖文】：

經(jīng)注釋編碼基因的５．９％，轉錄因子做為復雜的信號網(wǎng)絡中的成員，在調節(jié)植物應對來逡逑圍環(huán)境脅迫反應的過程中，發(fā)揮著重要的作用ｔ２＂６１。逡逑ＮＡＣ轉錄因子其命名來源于科學家從矮牽牛和擬南芥逡逑中克隆出來的邋ＮＡＣ邋基因邋ＮＡＭ邋（Ｎｏ邋Ａｐｉｃａｌ邋Ｍｅｒｉｓｔｅｍ）邋［７］，ＡＴＡＦ１／２邋（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｉａｎａ邋ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）和邋ＣＵＣ２邋（ｃｕｐ－ｓｈａｐｅｄ邋ｃｏｔｙｌｅｄｏｎ）邋［８］。他們所編碼的蛋白質，Ｎ邋端結逡逑氨基酸序列都高度保守且具有較高的同源性。逡逑ＮＡＣ轉錄因子結構特點逡逑典型的ＮＡＣ轉錄因子蛋白具模塊化組織，通常由高度保守的Ｎ端結構域和一個可高的Ｃ端轉錄調節(jié)域組成。Ｎ端結構域一般包含１５０個氨基酸，能夠再次細分為５個逡逑構域（Ａ－Ｅ）［９］。在５個亞結構域中，核定位作用以及參與ＤＮＡ結合的功能主要由Ａ、逡逑保守性較氋的亞結構域負責；Ｂ、Ｅ這兩個亞結構域與生長發(fā)育期的調控和植物組織逡逑性等有關，是ＮＡＣ轉錄因子功能多樣性決定性區(qū)域，所以保守性較低，具有發(fā)散性。逡逑蛋白Ｃ端具有高度特異性，是轉錄激活功能區(qū)，能起到轉錄激活或轉錄抑制作用逡逑Ａ邋．邋．．邋．．邐．．．邐．邐Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ邋ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，邋ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ，逡逑ＤＮＡ／ｐｒｏｔｅｔｎ邋ｂｍｄ．ｎｇ／ｄｉｍｅｎｚａｔｉｏｎ

共同調控角果成熟，并在角果細胞的程序化死亡過程扮演主要角色［１８］。逡逑１．３．２參與非生物脅迫逡逑關于ＮＡＣＴＦｓ在非生物脅迫中的功能，前人己做了深入研究（圖２）。在擬南芥中，逡逑通過對和ａｔｏ／７－２突變體［１９１以及ＡＴＡＦ１轉基因過表達植株的研究［２Ｇ］，我們可知逡逑ＡＴＡＦ１在干旱脅迫中既可能是正調控也可能是負調控，這可能是由于ＮＡＣ基因在擬南芥逡逑中功能冗余造成的［１９，２１］。植物激素ＡＢＡ、干旱脅迫、高溫脅迫都能誘導ＡＮＡＣ０５５和逡逑ＡＮＡＣ１９，這兩個轉錄因子可以和脫水誘導早期應答基因ＥＲＤ１啟動子特異結合，進一步逡逑過量表達和能夠誘導下游抗旱相關靶基因的表達，從而提高擬南芥的逡逑抗旱性［２２］。擬南芥中ＮＡＣ家族的另一個轉錄因子ＮＡＣ０１６，可以與下游靶基因兄？的逡逑啟動子結合，抑制」及五５７表達番茄中過量表達基因，能夠誘導低溫脅迫相關基逡逑因的表達

１．３．３參與生物脅迫逡逑大量研宄報道ＮＡＣＴＦｓ在針對不同病原體調控植物防御反應方面也具有重要作用。如逡逑圖３所示ＮＡＣ轉錄因子作為應對生物脅迫轉錄調控的關鍵組分，調控植物防御反應。逡逑ＮＡＣ蛋白可通過植物激素信號途徑激活抗病相關基因（Ｐｉ？），通過在感染部位誘導超逡逑敏反應（ＨＲ）使細胞程序性死亡，來調節(jié)植物防御反應［２８，２９】。研宄表明，ＮＡＣ基因在參與逡逑植物不同的激素信號傳導途徑中發(fā)揮不同的調節(jié)作用。擬南芥中可以被植物激素逡逑ＪＡ、ＳＡ誘導表達，而ＪＡ、ＳＡ是植物抗病防御途徑的關鍵激素。過量表達ＪＺ４Ｆ２會使擬逡逑南芥中抗病相關基因表達下調，對病原真菌的抵抗力明顯下降，這說逡逑明在抗病反應中起負調節(jié)作用［３（）Ｕ水稻稻瘟病菌能夠誘導ＣＷ＼＾Ｃ＜５的表達，逡逑ＯｓＡ＾ａ？與擬南芥親緣關系密切。此外還發(fā)現(xiàn)，在轉基因的水稻中稻瘟病逡逑菌入侵速度大大減緩，水稻抗稻瘟病的能力顯著上升［２５］。ＣＷＶ＾Ｃ７９基因可以被茉莉酸甲酯逡逑（ＭｅＪＡ）、脫落酸（ＡＢＡ）、乙烯（ＥＴ）等誘導表達

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本文編號：2808871