環(huán)鳥(niǎo)苷二磷酸(c-di-GMP)是廣泛存在于細(xì)菌中一種重要的第二信使分子,在銅綠假單胞菌中,主要參與細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)粘附行為及生物被膜形成的調(diào)節(jié)。隨著合成生物學(xué)特別是光響應(yīng)系統(tǒng)的發(fā)展,以環(huán)鳥(niǎo)苷二磷酸為對(duì)象的相關(guān)應(yīng)用型研究也越來(lái)越多。本文的第一部分主要以環(huán)鳥(niǎo)苷二磷酸為對(duì)象,通過(guò)設(shè)計(jì)構(gòu)造了單色光響應(yīng)和雙色光響應(yīng)兩套系統(tǒng),在利用單色光響應(yīng)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)對(duì)單細(xì)菌的追蹤操縱后,通過(guò)進(jìn)一步的優(yōu)化并建立雙色光響應(yīng)系統(tǒng),利用靜態(tài)圖案化投影技術(shù),經(jīng)過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)體系、實(shí)驗(yàn)條件的不斷優(yōu)化測(cè)試,最終實(shí)現(xiàn)了活細(xì)菌生物被膜的可逆定向生物打印。由于工程菌種具有很強(qiáng)的可改造性,光響應(yīng)系統(tǒng)的建立為研究新型抗菌表面、新型活細(xì)菌生物材料及其他應(yīng)用領(lǐng)域提供了新的方法和思路。而本文的第二部分主要基于三色熒光報(bào)告系統(tǒng)設(shè)計(jì)了一套精準(zhǔn)定量細(xì)胞內(nèi)同源重組發(fā)生概率的新方法,即三色熒光成像重組率計(jì)算系統(tǒng)(Three-color Fluoresencent Proteins based Recombination Rate Calculator System,TFPRRCS),經(jīng)過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)以及進(jìn)一步測(cè)序的方法驗(yàn)證了該系統(tǒng)的準(zhǔn)確性。利用該系統(tǒng)建立的新方法,可以快速準(zhǔn)確地定量細(xì)胞內(nèi)同源重組發(fā)生的概率,通過(guò)對(duì)16組重組相關(guān)的突變株重組率的定量,發(fā)現(xiàn)recA基因的缺失顯著降低了銅綠假單胞菌中同源重組發(fā)生概率,而uvrD和radA基因的缺失則顯著地提升了銅綠假單胞菌中同源重組發(fā)生概率,但uvrDrecA和radArecA基因雙缺失則將銅綠假單胞菌中同源重組發(fā)生概率拉回到較低水平。同時(shí),利用該方法表征了銅綠假單胞菌中不同生理?xiàng)l件下的同源重組發(fā)生概率,發(fā)現(xiàn)環(huán)丙沙星可以顯著地提高銅綠假單胞菌內(nèi)同源發(fā)生概率,提高胞內(nèi)c-di-GMP水平也同樣能顯著地提高銅綠假單胞菌內(nèi)同源發(fā)生概率。另外,利用該方法探究不同基因組結(jié)構(gòu)對(duì)重組率的影響,發(fā)現(xiàn)在相同同源臂間距下,同源臂的序列長(zhǎng)度越長(zhǎng),重組發(fā)生的概率則越高,在一定區(qū)間內(nèi),同源臂長(zhǎng)度和重組率大小成指數(shù)關(guān)系,但是同源臂長(zhǎng)度小于或大于一定數(shù)值時(shí)這種相關(guān)性則消失,通過(guò)建模完美地?cái)M合了同源臂長(zhǎng)度和重組率大小之間的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)DNA同源重組過(guò)程中的鏈交換過(guò)程是由熵驅(qū)動(dòng)的,并且鏈交換的過(guò)程對(duì)堿基錯(cuò)配的容忍度很低,而不同同源臂間隔、不同基因組插入位置、不同培養(yǎng)時(shí)間以及不同啟動(dòng)子等條件對(duì)重組率的影響都沒(méi)有顯著性差異。
【學(xué)位單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：Q93
【部分圖文】：

第一章 緒論1.1 細(xì)菌的第二信使：環(huán)鳥(niǎo)苷二磷酸所謂第二信使分子是指細(xì)胞內(nèi)通過(guò)信號(hào)分子自身濃度的變化來(lái)應(yīng)答胞外信號(hào)導(dǎo)影響胞內(nèi)受體的一類非蛋白類小分子。真核生物中的第二信使包括環(huán)腺苷cAMP）、環(huán)鳥(niǎo)苷酸（cGMP）、1,2-二酰甘油（DAG）、1,4,5-三磷酸肌醇（IP3）離子等，而原核生物的第二信使包括環(huán)腺苷酸（cAMP）、鈣離子、環(huán)二腺苷c-di-AMP）以及本文的研究對(duì)象環(huán)鳥(niǎo)苷二磷酸（c-di-GMP）等[1]。環(huán)鳥(niǎo)苷二磷兩個(gè) GTP 分子經(jīng)二鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶環(huán)化而成，如圖 1.1 所示[2]，也可被磷酸二酯解成 pGpG 或者分解成 GMP 單核苷酸。研究表明，c-di-GMP 參與調(diào)解多種生程，包括細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)黏附行為、生物被膜的形成及其致病性等，其相關(guān)研究對(duì)被膜的防治和抗生素耐藥等[3]問(wèn)題具有重要意義。

般都具有合成 c-di-GMP 的能力，除此之外，部分二鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶還具有其他生功能。例如，在新月柄桿菌（C.crescentus）中，二鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶還參與到細(xì)胞的調(diào)控中。新月柄桿菌分裂時(shí)，具有 GGDEF 和 EAL 結(jié)構(gòu)域的蛋白被分開(kāi)至細(xì)兩極，比如二鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶 PleD 則定位至新月柄桿菌的葉柄狀一極，合-di-GMP 關(guān)閉鞭毛的運(yùn)動(dòng)馬達(dá)、抑制細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)，直至新的基因組復(fù)制周期的開(kāi)1]。磷酸二酯酶可以斷裂磷酸二酯鍵，通常包括磷酸二酯酶 C 和磷酸二酯酶 D、素、鞘磷脂磷酸二酯酶、DNA 酶、RNA 酶和限制性內(nèi)切酶等，但磷酸二酯酶熟功能還是分解 cAMP、cGMP 和 c-di-GMP 等。磷酸二酯酶通常包含 EAL 或D-GYP 結(jié)構(gòu)域，能夠?qū)?c-di-GMP 分解成 pGpG 或者 GMP，例如銅綠假單胞菌包含有 21 個(gè) EAL 結(jié)構(gòu)域蛋白[12]。研究表明，Mg2+和 Mn2+在 c-di-GMP 的分解不可少，Zn2+和 Ca2+則可以抑制該水解過(guò)程，而 EAL 結(jié)構(gòu)域中的 Glu 同樣對(duì)水活性是必須的，因?yàn)?E 至 A 的突變是可以使該水解活性失活[13, 14]。

1.1.2 環(huán)鳥(niǎo)苷二磷酸的作用機(jī)理環(huán)鳥(niǎo)苷二磷酸參與調(diào)控多種細(xì)胞功能，主要通過(guò)核糖開(kāi)關(guān)[15]、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子[16]、包含 PliZ結(jié)構(gòu)域蛋白[17-19]和退化的 GGDEF 或 EAL結(jié)構(gòu)域蛋白[20]等來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)下游基因的調(diào)控。C-di-GMP 參與細(xì)胞功能的調(diào)控則主要通過(guò)與特定蛋白結(jié)合的形式來(lái)完成對(duì)下游基因的調(diào)控。例如 c-di-GMP 調(diào)節(jié)細(xì)菌纖維素合成時(shí)，能夠結(jié)合包含 PliZ 結(jié)構(gòu)域的 BcsA 蛋白來(lái)激活 BcsA-BcsB 復(fù)合體，從而激活細(xì)菌纖維素合成酶活性，這表示包含 PliZ 結(jié)構(gòu)域的 c-di-GMP 效應(yīng)蛋白或者比如新發(fā)現(xiàn)的 YajQ 蛋白家族[21]可以作為通用的適配器來(lái)連接 c-di-GMP 信號(hào)，輸入至酶蛋白或者轉(zhuǎn)錄因子來(lái)開(kāi)啟下游的表達(dá)。同時(shí)，c-di-GMP 也可以結(jié)合眾多的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，包括響應(yīng)調(diào)節(jié)因子或者 Crp家族蛋白等[22]。同樣地，c-di-GMP 也能夠結(jié)合來(lái)源于銅綠假單胞菌的 FleQ 蛋白的AAA+ ATP 酶結(jié)構(gòu)域，或者結(jié)合組氨酸激酶，如新月柄桿菌中的 CckA 蛋白，來(lái)調(diào)節(jié)下游基因回路[23, 24]。另一方面，c-di-GMP 也可以通過(guò)核糖開(kāi)關(guān)來(lái)調(diào)控下游基因的表達(dá)，Sudarsan 等發(fā)現(xiàn)在霍亂弧菌等真細(xì)菌中，c-di-GMP 可以結(jié)合 mRNA 來(lái)參與下游

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