【摘要】：磷酸二酯酶(Phosphodiesterases,PDEs)在細胞信號轉導過程中發(fā)揮重要作用,其能夠水解胞內第二信使cAMP(環(huán)磷酸腺苷),從而終止cAMP所參與的信號轉導途徑的功能。目前,在大多數(shù)真菌中報道的磷酸二酯酶家族包含了高親和性磷酸二酯酶(pde2/pdeH)和低親和性磷酸二酯酶(pdel/pdeL),它們在真菌的營養(yǎng)菌絲生長和致病性發(fā)育過程中發(fā)揮了重要的調控作用。捕食線蟲真菌的代表菌株-寡孢節(jié)叢孢(Arthrobotrys oligospora)在饑餓條件下產生三維菌網(wǎng)(three-dimensional networks)作為捕食器官捕捉線蟲為自身生長獲取營養(yǎng),但是捕食器官形成的信號調控機制還不清楚。本論文以寡孢節(jié)叢孢中與構巢曲霉等絲狀真菌同源的高親和性磷酸二酯酶(AoPdeH,AOL s00083g160)和低親和性磷酸二酯酶(AoPdeL,AOL s00097g378)為研究對象,對磷酸二酯酶編碼基因進行敲除,探究磷酸二酯酶在寡孢節(jié)叢孢營養(yǎng)菌絲生長和致病性發(fā)育過程中所發(fā)揮的功能。主要實驗結果:1.磷酸二酯酶的功能結構域和聚類分析對寡孢節(jié)叢孢兩種磷酸二酯酶的功能結構域分析表明,AoPdeH含有以下的保守結構域和位點:3'5'-環(huán)核苷酸磷酸二酯酶超家族結構域(IPR036971)、磷酸二酯酶結構域(IPR003607)、3'5'-環(huán)核苷酸磷酸二酯酶催化結構域(IPR002073)和3'5'-環(huán)核苷酸磷酸二酯酶保守位點(IPR023174);AoPdeL也含有多個保守結構域,包括是富含亮氨酸的重復結構域超家族(IPR032675)、核糖核酸酶Z/羥基�；入赘孰乃饷笜�(IPR036866)和cAMP磷酸二酯酶結構域(IPR000396)。聚類分析表明,AoPdeH和AoPdeL分別聚類于2個不同進化分支上,由此可以初步推斷這兩個蛋白在真菌中可能發(fā)揮著不同的作用。2.磷酸二酯酶敲除突變株的營養(yǎng)菌絲生長、抗逆性和致病性分析利用同源重組技術對兩種磷酸二酯酶編碼基因進行敲除,成功獲得兩種磷酸二酯酶基因的敲除突變株,對突變株的菌絲形態(tài)、生長速率、抗逆境脅迫能力、殺線蟲能力、胞外蛋白酶活性以及三維菌網(wǎng)形態(tài)和數(shù)量進行了統(tǒng)計比較。結果發(fā)現(xiàn)AoPdeH基因的缺失造成其突變株生長速率顯著減慢、氣生菌絲出現(xiàn)缺陷、菌絲橫膈膜增多且發(fā)生膨大變形、對環(huán)境壓力敏感性增強,除此之外,ΔAoPdeH突變株失去形成成熟三維菌網(wǎng)的能力,殺線蟲能力顯著降低但并沒有完全喪失殺線蟲能力,對其發(fā)酵液進行蛋白酶活性分析,發(fā)現(xiàn)突變株胞外蛋白酶活性沒有明顯變化。然而,ΔAoPdeL突變株的生長速率、抗逆境脅迫能力與寡孢節(jié)叢孢野生型菌株相比沒有顯著差異,殺線蟲能力和產生三維菌網(wǎng)數(shù)量有所下降,菌絲形態(tài)有膨大變形現(xiàn)象。以上實驗結果表明AoPdeH參與了寡孢節(jié)從孢的菌絲生長、抗逆性和致病性發(fā)育相關的生物學過程的調控。3.磷酸二酯酶參與產孢過程的調控產孢量比較發(fā)現(xiàn),ΔAoPdeH突變株分生孢子產量僅為野生型菌株孢子產量的2～6%,ΔAoPde 突變株的分生孢子產量與野生型菌株相比無顯著差異。光學顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),兩種磷酸二酯酶基因突變株孢子形態(tài)皆發(fā)生變形,變得狹長無橫膈膜,除此之外ΔAoPdeH突變株分生孢子梗的數(shù)量明顯少于野生型菌株,且孢子梗上幾乎沒有孢子著生,ΔAoPdeL突變株分生孢子梗數(shù)量及孢子著生方式與寡孢節(jié)叢孢野生型菌株相比無明顯差異。為進一步探討磷酸二酯酶對產孢的調控作用,選取13個產孢調控基因在產孢初期(3 days)、產孢中期(5 days)和孢子成熟期(7 days)進行熒光定量PCR分析,結果表明,ΔAoPdeH突變株13個產孢調控基因中FlbA、Acr1、FluG、VelB、NsdD、FlbC、PkaC1、Plp1、AbaA、LreA和LreB的轉錄水平皆下調,而在分生孢子產量與野生型菌株沒有明顯差異的ΔAoPdeL突變株中,13個產孢調控基因的轉錄水平與野生型菌株相比無明顯變化。以上實驗結果表明AoPdeH參與了寡孢節(jié)叢孢的產孢過程的調控。4.磷酸二酯酶參與寡孢節(jié)叢孢菌絲內cAMP水平調控通過酶聯(lián)免疫法測定突變株營養(yǎng)菌絲生長和致病性發(fā)育過程中不同時間點的菌絲內cAMP含量,結果表明,在所選取的所有時間點ΔAoPdeH敲除株和ΔAoPdeL敲除株菌絲內cAMP含量均高于寡孢節(jié)叢孢野生型菌株。為進一步分析磷酸二酯酶對cAMP水平的調控機制,選取16個磷酸二酯酶上下游的關鍵基因以及參與調節(jié)cAMP含量的相關基因進行熒光定量PCR(RT-PCR)分析,其中cAMP受體樣蛋白和cAMP反應原件結合蛋白、腺苷酸環(huán)化酶表達量發(fā)生了明顯變化(在菌絲生長發(fā)育期間顯著上調,致病性發(fā)育期間顯著下調),說明磷酸二酯酶可能通過調控上述基因的表達水平從而參與寡孢節(jié)叢孢cAMP含量的調節(jié)。本文的創(chuàng)新點:1.首次在寡孢節(jié)叢孢中成功敲除了磷酸二酯酶家族的蛋白編碼基因,發(fā)現(xiàn)AoPdeH參與寡孢節(jié)從孢營養(yǎng)菌絲生長、無性產孢、抗逆境脅迫壓力、捕食器官形成和菌絲內cAMP含量調節(jié)等重要生物學過程的調控。2.通過RT-PCR比較了AoPdeH、AoPdeL、分生孢子發(fā)育調控以及cAMP合成等相關基因在ΔAoPdeH突變株、ΔAoPdeL突變株和野生型菌株中不同時間點的轉錄水平變化,推測磷酸二酯酶參與寡孢節(jié)叢孢中分生孢子的發(fā)育以及cAMP合成等相關基因的表達調控。
【學位授予單位】：云南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：Q78
【圖文】：

在大部分真核生物中異源三聚體Ｇ蛋白的信號傳導是通過利用ｃＡＭＰ邋（ｃｙｃｌｉｃ逡逑ＡＭＰ）作為第二信使來介導細胞外刺激從而對細胞內下游信號傳導組分的轉導［２５］。逡逑己經發(fā)現(xiàn)ｃＡＭＰ信號級聯(lián)的組分（圖１－３）在各種真菌中是高度保守的信號傳導模逡逑塊，其影響和調節(jié)真核生物在生長、發(fā)育和形態(tài)發(fā)生過程中的一系列基本細胞過逡逑程。而響應配體刺激的ＧＰＣＲ，通過膜錨定的腺苷酸環(huán)化酶形成了許多空間分離的逡逑ｃＡＭＰ產生源頭，在響應于細胞外刺激后，在整個細胞中就有多個ｃＡＭＰ源點被逡逑激活，導致ｃＡＭＰ的穩(wěn)態(tài)水平的逐漸積累，在達到臨界閾值濃度時，ｃＡＭＰ可以逡逑進一步激活幾種重要的效應物（最重要的是ＰＫＡ

逡逑圖１－２寡孢節(jié)叢孢捕器形成的調控模型［１３１逡逑Ｆｉｇ．邋１－２邋Ｔｈｅ邋ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ邋ｍｏｄｅｌ邋ｏｆ邋ｔｒａｐ邋ｆｏｒｍａｔｉｏｎ逡逑３邋ｃＡＭＰ信號級聯(lián)研究進展逡逑在大部分真核生物中異源三聚體Ｇ蛋白的信號傳導是通過利用ｃＡＭＰ邋（ｃｙｃｌｉｃ逡逑ＡＭＰ）作為第二信使來介導細胞外刺激從而對細胞內下游信號傳導組分的轉導［２５］。逡逑己經發(fā)現(xiàn)ｃＡＭＰ信號級聯(lián)的組分（圖１－３）在各種真菌中是高度保守的信號傳導模逡逑塊，其影響和調節(jié)真核生物在生長、發(fā)育和形態(tài)發(fā)生過程中的一系列基本細胞過逡逑程。而響應配體刺激的ＧＰＣＲ，通過膜錨定的腺苷酸環(huán)化酶形成了許多空間分離的逡逑ｃＡＭＰ產生源頭，在響應于細胞外刺激后，在整個細胞中就有多個ｃＡＭＰ源點被逡逑激活，導致ｃＡＭＰ的穩(wěn)態(tài)水平的逐漸積累，在達到臨界閾值濃度時，ｃＡＭＰ可以逡逑進一步激活幾種重要的效應物（最重要的是ＰＫＡ，一種ｃＡＭＰ依賴性蛋白激酶Ａ），逡逑進而介導廣泛的下游生理效應［２６１逡逑４逡逑

Ｃｏｍｐｕｔｅ邋ｐＩ／Ｍｗ邋ｔｏｏｌ分析表明，ＡｏＰｄｅＨ蛋白的相對分子質量和等電點分另（Ｊ為逡逑８５．３邋ｋＤａ和６．３７。利用Ｉｎｔｅｒｐｒｏｓｃａｎ和ＢＬＡＳＴ對寡孢節(jié)叢孢ＡｏＰｄｅＨ蛋白的結構逡逑域進行了分析，結果如下（圖２－１、２），其含有一個３’５＇－環(huán)核苷酸磷酸二酯酶超家逡逑族結構域（ＩＰＲ０３６９７１）、一個磷酸二酯酶結構域（ＩＰＲ００３６０７）、一個３’５’－環(huán)核逡逑苷酸磷酸二酯酶催化結構域（ＩＰＲ００２０７３）和３’５’－環(huán)核苷酸磷酸二酯酶保守位點逡逑（ＩＰＲ０２３１７４）。逡逑Ｐｕｔａｔｉｖｅ邋ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ邋ｄｏｍａｉｎｓ邋ｈａｖｅ邋ｂｅｅｎ邋ｄｅｔｅｃｔｅｄ，邋ｃｌｉｃｋ邋ｏｎ邋ｔｈｅ邋ｉｍａｇｅ邋ｂｅｌｏｗ邋ｆｏｒ邋ｄｅｔａｉｌｅｄ邋ｒｅｓｕｌｔｓ．逡逑１邐１２５邐２Ｓ？邐３７５邐ｓｏｔ邐６２Ｓ邐ｍ逡逑，邋，逡逑Ｋ？２＋邋ｂｉｎ４ｉｎ？邋ｓｉｔ＊逡逑Ｓｐｅｃｉｆｉｃ邋ｈｉｔｓ邐ＰＤＥａｓｅ＿Ｉ．逡逑Ｓｕｐｅｒｆａｎｉｌｉｅｓ邐ＨＯｃ邋ｓｕｐｅｒ－Ｔａｍｉ邋ｌｙ逡逑圖２－１邋ＡｏＰｄｅＨ蛋白的比對分析逡逑Ｆｉｇ．邋２－１邋Ｂｌａｓｔ邋ａ

【參考文獻】

相關期刊論文 前7條

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本文編號：2791628