【摘要】：紫色紫孢菌(Purpreocillium lavendulum)是目前已實現(xiàn)商品化的線蟲生防真菌。本研究以紫色紫孢菌Ku80敲除菌株為出發(fā)菌株,首先利用同源重組的方法對組蛋白H3K14位點進行點突變,同時敲除修飾組蛋白H3K14乙�；慕M蛋白乙�；D(zhuǎn)移酶gcn5,之后對Ku8K敲除菌株和各突變株的生長和產(chǎn)孢進行測定和比較,并結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)和基因功能分析等方法研究組蛋白H3K14乙酰化調(diào)控紫色紫孢菌的生長和產(chǎn)孢的機制。通過以上研究可以初步闡明組蛋白修飾調(diào)控紫色紫孢菌產(chǎn)孢的分子機制。主要研究結(jié)果如下:1.獲得H3K14突變菌株首先獲得H3K14位點突變成R和Q的H3片段,然后酶切質(zhì)粒H3-3'-pPK2-sur-GFP,經(jīng)過In-fusion酶連接將突變片段連接到sur基因的另一端。將構(gòu)建好的突變載體通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化紫色紫孢菌Ku80菌株,用氯啼磺隆篩選轉(zhuǎn)化子,通過測序和Western blot的方法對轉(zhuǎn)化子進行驗證。2.獲得gcn5敲除菌株首先酶切質(zhì)粒pPK2-sur-GFP,然后經(jīng)過In-fusion酶連接將gcn5上下游同源片段連接到sur基因的兩端。將構(gòu)建好的敲除載體通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化紫色紫孢菌Ku80菌株,用氯嘧磺隆篩選轉(zhuǎn)化子,通過PCR等方法對轉(zhuǎn)化子進行驗證。3.突變株和敲除株的生長和產(chǎn)孢受到影響Ku80菌株的孢子形成能力相對高于突變株和敲除株。在所研究培養(yǎng)基上,除PDA培養(yǎng)基外,H3K14Q突變株和gcn5敲除株與Ku80菌株相比生長速度均降低。然而,在PDA培養(yǎng)基上,H3K14R突變株的生長速度相對高于Ku80菌株,并且在其它培養(yǎng)基上沒有顯著變化。4.各突變株和敲除株的轉(zhuǎn)錄組分析組蛋白的翻譯后修飾會影響染色質(zhì)的結(jié)構(gòu),從而會影響基因的表達[2]。不管是H3K14R突變株還是H3K14Q突變株,或者是gcn5敲除株,與Ku80菌株相比,組蛋白H3K14的乙�；骄幱诋惓顟B(tài)。這種非正常的乙酰化或者去乙�；癄顟B(tài)將會影響紫色紫孢菌的一些生長和產(chǎn)孢相關(guān)基因,從而導(dǎo)致H3K14Q突變株和gcn5敲除株的生長和孢子形成能力的降低,以及H3K14R突變株產(chǎn)孢能力的降低。為了在不同菌株中發(fā)現(xiàn)這些受影響的生長和孢子形成相關(guān)基因,分析了上述的表型,確定樣品收集的時間點,將Ku80菌株和各轉(zhuǎn)化子的樣品進行轉(zhuǎn)錄組分析比較。對表型有明顯差異的菌株之間的差異基因進行分析,找出依賴表觀遺傳修飾的代謝相關(guān)基因。本論文的主要創(chuàng)新點:真菌在營養(yǎng)匱乏的環(huán)境中停止生長并產(chǎn)孢是其重要的生存策略,從表觀遺傳調(diào)控的角度探討?zhàn)囸I誘導(dǎo)真菌生活史轉(zhuǎn)化的分子機理并未見報道,本研究從組蛋白H3K14突變體出發(fā),通過篩選PDA中營養(yǎng)脅迫的營養(yǎng)物質(zhì),結(jié)合轉(zhuǎn)錄組分析和突變體庫篩選等方法試圖闡明組蛋白H3K14介導(dǎo)的營養(yǎng)脅迫誘導(dǎo)產(chǎn)孢的分子機制,為全面理解真菌適應(yīng)環(huán)境脅迫調(diào)控生活史轉(zhuǎn)變的生存策略奠定理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：云南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q939
【圖文】：

組蛋白H3K14位點所受修飾Figurel一1ModificationofHist朋eH3K14Site資料來源:表觀遺傳修飾，ab.~官網(wǎng)

Ｆｉｇｕｒｅ邋１－２邋Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ邋Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ邋Ｇｅｎｅｓ邋Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ邋ｂｙ邋ＧＣＮ５，２９＊逡逑文研究思路及內(nèi)容逡逑球農(nóng)業(yè)病害中，植物寄生線蟲己經(jīng)上升為第二大農(nóng)業(yè)病害。據(jù)統(tǒng)計，全逡逑，由于植物寄生線蟲的破壞造成的年度經(jīng)濟損失超過１５７０億美元［３４】，逡逑言，至２０００年全國每年累計發(fā)生各種病蟲害的面積高達３億公頃，其中逡逑

第三章實驗結(jié)果與分析逡逑第三章實驗結(jié)果與分析逡逑．組蛋白Ｈ３Ｋ１４的突變影響紫色紫孢菌的生長和產(chǎn)孢逡逑１含有Ｑ／Ｒ突變位點的Ｈ３片段的獲得：逡逑用使用ＮＥＢｃｈａｎｇｅｒ設(shè)計的Ｈ３Ｋ１４的Ｑ和Ｒ突變引物以及Ｑ５點突變試劑盒逡逑５邋Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ邋Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ邋Ｋｉｔ）ＰＣＲ邋擴增質(zhì)粒邋ｐＥＡＳＹ－Ｂｌｕｎｔ邋Ｚｅｒｏ邋Ｃｌｏｎｉｎｇ邋Ｋｉｔ，逡逑ＬＤ反應(yīng)后轉(zhuǎn)化大腸感受態(tài)，挑取單菌落進行測序得到突變的菌株。測序結(jié)果如逡逑３－１－１、２所示：逡逑

【參考文獻】

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本文編號：2788488