發(fā)布時(shí)間：2020-07-24 21:25

【摘要】：角蛋白(Keratin)是一類廣泛存在于自然界的非營(yíng)養(yǎng)型硬蛋白,主要分布在動(dòng)物的皮毛、蹄甲部位,結(jié)構(gòu)中含有大量氫鍵、半胱氨酸構(gòu)成的二硫鍵,二硫鍵相互作用形成致密的角蛋白結(jié)構(gòu)使其難以被降解利用。角蛋白酶(Keratianse)是一種可以特異性降解角蛋白的酶類,它能破壞羽毛角蛋白致密的結(jié)構(gòu)達(dá)到降解的目的。為了更好的利用角蛋白和開發(fā)角蛋白酶基因本研究從戈壁異常球菌(Deinococcus gobiensis)I-0和耐輻射異常球菌(Deinococcus radiodurans)R1中鑒定了三個(gè)角蛋白酶基因,分別命名為Kerdg1(DGO_RS02895)、Kerdg2(DGO_RS03965)、Kerdr(A2G07_RS01950),并在大腸桿菌中進(jìn)行了異源表達(dá)和羽毛降解特性研究。主要結(jié)果如下:1、為了研究這三個(gè)基因,分析其序列結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)Kerdg1由1239堿基組成可編碼412個(gè)氨基酸殘基,分子量為:41.1 kDa;Kerdg2由1599堿基組成編碼532個(gè)氨基酸殘基,分子量為:53.78 kDa;Kerdr由1599堿基組成編碼532個(gè)氨基酸殘基,分子量為:53.39kDa。序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)KerDG1、KerDG2、KerDR蛋白含有跨膜結(jié)構(gòu)和前導(dǎo)肽。結(jié)構(gòu)中信號(hào)肽(The signal peptide)、N端前肽(N-terminal pro-peptide)、成熟蛋白區(qū)(mature protease)、C端尾巴(C-terminal pro-peptide)這四個(gè)部分與peptidases_s8_s53家族蛋白相似,此外成熟蛋白區(qū)都有3個(gè)主要的氨基酸殘基(Asp、His、Ser)與已知的芽孢桿菌角蛋白酶(KerA)一致,確認(rèn)三個(gè)基因是角蛋白基因。2、將這3個(gè)角蛋白基因分別連接到pET22b載體中,并轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主BL21進(jìn)行原核表達(dá)。對(duì)重組菌株進(jìn)行降解能力分析,結(jié)果顯示重組菌株對(duì)羽毛的降解作用明顯。對(duì)重組菌株作用于羽毛后的產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示降解產(chǎn)物主要產(chǎn)生精氨酸、酪氨酸、脯氨酸、胱氨酸等21種氨基酸。3、將重組菌株誘導(dǎo)表達(dá),SDS-PAGE電泳分析結(jié)果顯示在菌液中、菌體上清中均能獲得目的蛋白。對(duì)角蛋白酶酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)KerDG1最適pH和溫度是5.0和60℃,酶活3.5 U/mL。KerDG2的最適pH和溫度是8.0和40℃,酶活是3.0 U/mL。KerDR的最適pH和溫度是7.0和40℃,酶活是3.0 U/mL。耐受性實(shí)驗(yàn)表明角蛋白酶能耐受一定的溫度和pH。同時(shí),還發(fā)現(xiàn)酶對(duì)金屬離子和化學(xué)試劑也有一定的耐受性。
【學(xué)位授予單位】：西南科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：X705;X172
【圖文】：

2 kerdg1、kerdg2、kerdr 角蛋白酶的生物信息分析結(jié)構(gòu)主要分四個(gè)部分（圖 2-2 已用黑箭頭標(biāo)出）：信號(hào)肽 The signal peptide (pre)，N 端前肽 N-terminal pro-peptide ，成熟 蛋白區(qū) mature protease，C 端尾巴 C-terminalpro-peptide (C-pro)[76]5。成熟蛋白區(qū)（圖 2-2 紅色括號(hào)內(nèi)）有 3 個(gè)活性位點(diǎn)氨基酸殘基分別是 171 位的天冬氨酸殘基、203 位的組氨酸殘基、358 位的絲氨酸殘基。氨基酸序列預(yù)測(cè)圖表明該蛋白前端有一段序列形成前導(dǎo)肽，跨膜結(jié)構(gòu)分析結(jié)果還顯示該蛋白存在跨膜結(jié)構(gòu)。

建及鑒定菌屬角蛋白酶功能，本研究對(duì)耐輻射異常球耐輻射異常球菌含有 1 個(gè)角蛋白酶基因（k因（kerdg1、kerdg2）。根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)特0 基因組中克隆出角蛋白酶基因，電泳結(jié)果 kerdr 條帶單一，與理論分子量一致。回收酶切kerdg1、kerdr 的 PCR 產(chǎn)物和 pET 22b 表rdg2 的 PCR 產(chǎn)物和 pET-22b 表達(dá)載體并進(jìn)行過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21 (DE3)的 LB 平板培養(yǎng)后進(jìn)行篩選。挑取單菌落進(jìn) 2~5 中均有目的基因。提取重組菌株的質(zhì)粒進(jìn)因均已成功插入載體。驗(yàn)證正確后送北京擎核表達(dá)載體 pET22b-kerdg1、pET22b-kerdg2菌株加入 70 %甘油（終濃度為 10-20%）于圖如圖 3-4。

圖 3-2 菌落 PCR 驗(yàn)證結(jié)果Fig.3-2 Results of PCR validation colonies：Trans2K PlansⅡmarker；1~6：分別是 pET22b-kerdg1 單菌落 1~6；7：陰性。b：M：Trans2K PlansⅡmarker；1~5：分別是 pET22b-kerA 單菌落 1~5；6：照；8：空白。c：M：Trans2K PlansⅡmarker；1~6：分別是 pET22b-kerdg2 單照；8：陽性對(duì)照 d：M：Trans2K PlansⅡmarker；1：陽性對(duì)照；2~6：分別是 pE5；7：空白；8：陰性對(duì)照。:Trans2K PlansⅡmarker；1~6: pET22b-kerdg1 colony 1~6；7: negative control；: M:Trans2K PlansⅡmarker；1~5: pET22b-kerA colony 1~5；6: negative control；8: blank space. c: M:Trans2K PlansⅡmarker；1~6: pET22b-kerdg2 colony 1~6；: positive control. d: M:Trans2K PlansⅡmarker；2: positive control；2~6: pET22b-ank space；8: negative control.20001000

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本文編號(hào)：2769412