【摘要】：嗜熱酯酶是最具有應(yīng)用潛力的綠色生物催化劑之一,因其具有耐熱性、pH穩(wěn)定性和有機溶劑耐受性等特點廣泛應(yīng)用于各個行業(yè)。前期從超嗜熱菌Aquiex aeolicus VF5(風產(chǎn)液菌)基因組中篩選得到一種嗜熱酯酶基因Aaeo1,實現(xiàn)了其在大腸桿菌系統(tǒng)(Escherichia coli)中的異源表達,發(fā)現(xiàn)其存在包涵體及催化活力低的問題。為了得到高效的嗜熱酯酶,利用定向進化對其進行分子改造,通過兩步高通量篩選法得到可溶性表達和催化活力同時提高的突變株并進行酶學性質(zhì)研究。具體包括:(1)建立了易錯PCR(error-prone PCR,epPCR)突變反應(yīng)體系。確定最優(yōu)條件:Mg~(2+)7 mmol·L~(-1),Mn~(2+)0.2 mmol·L~(-1),平均突變率為0.31%,滿足構(gòu)建文庫要求;(2)建立了靈敏、快速、高效的兩步高通量篩選法。以split-GFP為報告基因結(jié)合定向進化手段構(gòu)建突變文庫,與以全長增強型GFP(EGFP)為報告基因相比,有效地降低了篩選過程中的熒光背景和假陽性程度,陽性突變率從88%提高至95%。根據(jù)熒光強度與酶活力/蛋白濃度之間良好的線性關(guān)系,通過流式細胞分選儀從庫容量不小于10~4的突變文庫中初篩得到可溶性表達提高的突變株,對初篩目的菌株進行酶活力復(fù)篩;(3)篩選獲得了可溶性表達和酶活力同時提高的突變株。通過兩步高通量篩選得到了2株優(yōu)勢突變菌株EP1和EP2,分別含有4個氨基酸突變位點:I8V/I51V/F127I/E170D、V17G/H22R/K92N/I158K。可溶性蛋白含量是野生型的2倍左右,純化后的突變酶EP1和EP2的比活力分別是野生型的3.14、3.2倍左右。通過定點突變篩選得到突變株I51V、E170D和I51V/E170D的粗酶活分別是野生型的2.35、2.46、4.5倍。對兩個位點分別構(gòu)建小型飽和突變文庫,篩選后進行組合得到突變株I51L/E170D的酶活力是野生型的4.8倍左右。純化后突變酶I51V、E170D和I51L/E170D的比活力分別是野生型的6.86、10.01、14.86倍;(4)研究突變酶的一系列酶學性質(zhì)。突變酶均在70 ~oC時測定最大酶活性,突變后仍保持嗜熱性,且在高溫條件下更穩(wěn)定。突變酶的最適pH值均為8.0,且在微堿性環(huán)境下催化效果更佳。突變酶EP1和EP2的K_m值降低,說明突變酶對底物的親和力增強,k_(cat)/K_m值分別是原始酶的2.42、2.35倍,因此催化活性增強。突變酶I51V、E170D和I51L/E170D的K_m值提高,k_(cat)/K_m值分別是野生型Aaeo1的5.65、4.79、10.7倍,催化效率提高的主要原因可能是由于底物結(jié)合口袋的變化導致突變酶的催化能力的提高;(5)通過同源建模分析了Aaeo1突變體酶活提高的機制。蛋白質(zhì)分子空間結(jié)構(gòu)模擬顯示,推測E170D突變改變了Aaeo1的口袋。第170位點與活性位點Asp163的距離約為8.9?,第51位點與Ser62之間僅由一個β-sheet連接,可能會通過長距離或短距離影響酶活力的變化。
【學位授予單位】：江南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：Q55
【圖文】：

目前關(guān)于耐熱機制的提出大致可總結(jié)為：(1) 熱穩(wěn)定性是內(nèi)在的[6]。通過比和常溫菌的蛋白質(zhì)氨基酸組成的比較，發(fā)現(xiàn)嗜熱菌蛋白質(zhì)中 Ala、Pro、Arg、均高于常溫菌，而 Asn、Gln、Cys、Trp、Val、Ile 的含量顯著低于常溫菌；質(zhì)的耐熱性[7]。高溫環(huán)境下的菌的 GC 百分比高，那么意味著解鏈所需的溫度3) 蛋白高級結(jié)構(gòu)的空間相互作用[8]，如非共價力等。嗜熱蛋白酶離子結(jié)合位點離子(Ca2+、Mg2+等)起到促熱穩(wěn)定作用。隨著基因工程的出現(xiàn)和迅速發(fā)展，從種篩選、分離純化、酶學性質(zhì)的研究到結(jié)構(gòu)分析、催化機制、基因改造等方面究，開發(fā)了嗜熱酯酶在其他方面的應(yīng)用價值。 嗜熱酯酶的分子改造.1 理性和非理性蛋白質(zhì)設(shè)計的區(qū)別蛋白質(zhì)的改造可以分為理性設(shè)計和非理性設(shè)計，兩者之間的不同主要集中在以面：(1) 非理性設(shè)計不需要掌握關(guān)于酶的結(jié)構(gòu)和機制；(2) 理性設(shè)計適合二級結(jié)域的研究；(3) 非理性設(shè)計需要選擇策略；(4) 理性設(shè)計無點突變偏好性�；谀艿男畔⑦x擇酶改造策略如圖 1-1 所示：

實現(xiàn)其在大腸桿菌系統(tǒng)的異源表達，可溶性重組蛋白含量少且酶活力尚低，無法滿足工業(yè)需求。因此，就如何改善嗜熱酯酶在大腸桿菌中的可溶性表達和催化活性這兩方面展開探究。論文研究思路按圖 1-2 所示，通過優(yōu)化的 epPCR 條件對嗜熱酯酶基因任意位置插入突變，對于分子量為 24 KDa 的嗜熱酯酶基因來說，具有高催化活力的目的轉(zhuǎn)化子的獲得，需要構(gòu)建一個庫容量不小于 104的突變文庫。為了解決大部分嗜熱酯酶表現(xiàn)為不可溶形式和酶活力低的問題，首先嘗試了融合 EGFP 標簽實現(xiàn)可視化分析，發(fā)現(xiàn)以 EGFP為報告基因會造成篩選過程中的假陽性。為了解決這一問題，基于 split-GFP 為報告基因并結(jié)合定向進化手段構(gòu)建突變文庫，通過流式細胞分選儀對文庫進行快速、準確、高通量的初步篩選。根據(jù)熒光強度與酶活力/蛋白濃度之間的線性關(guān)系，通過測定全細胞熒光值獲得可溶性表達水平顯著提高的突變株，之后對初篩目的菌株進行酶活力的二次篩選。兩步高通量篩選后得到可溶性表達水平和催化活力同時提高的優(yōu)勢菌株，然后利用定點突變分析突變位點，將優(yōu)勢突變位點進行點飽和突變建立小型文庫以期得到酶活力進一步提高的菌株。對篩選得到的突變酶進行分離純化后進行一系列酶學性質(zhì)研究。最后，嘗試通過同源建模分析突變酶活力提高的機制。

圖 2-1 split-GFP 體內(nèi)自組裝系統(tǒng)(a) GFP 分為 3 段: GFP1-9、GFP10 and GFP11; (b) split-GFP 之間的熒光互補原理；Fig.2-1 Split-GFP complementation assay in vivo. (a) The GFP was divided into 3 fragments; (b) Principleof the split-GFP complementation assay. The Aaeo1 gene was inserted between GFP10 and GFP11. Whenthe detector fragment GFP1-9 was added, GFP10-Aaeo1-11 could spontaneously assemble with GFP1-9fragment to form GFP with fluorescence emission.2.2.5 突變文庫的構(gòu)建以 pET28a-Aaeo1 為模板，通過引物 EPA11F 和 EPA11R，按照優(yōu)化后的 epPCR 條件進行突變片段的擴增，上下游分別選擇 BamHI 和 EcoRI 酶切位點(下劃線所示)。EPA11F：5'-GCGGATCCATGCTGAAGAAC-3'EPA11R：5'-TTCGAATTCATACCCCTTTAAAATAGCTTT-3'50 μL epPCR 擴增體系：5 μL 10×epPCR buffer, 2.5 mmol·L-1dNTP, 100 mmol·L-1dCTP/dTTP, 20 mg·mL-1MgCl2, 1 mg·mL-1MnCl2, 20 μmol·L-1F/R, 2.5 U rTaq, 1 μL DNAddH2O 補齊至 50 μL。

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本文編號：2765046