【摘要】：粘質(zhì)沙雷氏菌生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生一種次級(jí)代謝產(chǎn)物靈菌紅素。靈菌紅素具有多種的生物活性,能夠抗瘧疾、抗腫瘤、免疫抑制等。野生型粘質(zhì)沙雷氏菌產(chǎn)生的靈菌紅素產(chǎn)量少,不能滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需求。單優(yōu)化培養(yǎng)基也不能使靈菌紅素的產(chǎn)量有很大的提高。隨著生物技術(shù)的發(fā)展,通過(guò)基因工程研究粘質(zhì)沙雷氏菌的產(chǎn)靈菌紅素基因,提高靈菌紅素的產(chǎn)量是一條可行的途徑。論文通過(guò)平板劃線法從湖水中分離純化得到的一株產(chǎn)色素菌株。用引物27F和1492R對(duì)菌株進(jìn)行16S rDNA擴(kuò)增。測(cè)序結(jié)果與NCBI基因庫(kù)中比對(duì)分析,確定菌株的屬種。然后,采用甲醇提取菌體中色素,將粗提取物進(jìn)行柱層析分離、純化,獲得較純的紅色色素。采用可見光光度計(jì),傅里葉紅外光譜(FTIR),高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)分析鑒定紅色色素。論文還研究了靈菌紅素基因克隆及載體的構(gòu)建。根據(jù)NCBI查找到的菌株同源序列,分別設(shè)計(jì)了含酶切位點(diǎn)的靈菌紅素合成酶引物和非編碼序列的引物。對(duì)靈菌紅素合成關(guān)鍵酶基因pigF和pigC進(jìn)行擴(kuò)增,并與pBM20-T載體連接,轉(zhuǎn)化篩選獲得克隆菌株。擴(kuò)增靈菌紅素基因簇前端的非編碼序列,通過(guò)重疊PCR(Overlap PCR)將非編碼序列同克隆基因拼接得到重組基因。將重組基因連接pBM16A-T后,轉(zhuǎn)入粘質(zhì)沙雷氏菌中,通過(guò)SDS-PAGE分析重組基因表達(dá)情況。論文得到以下結(jié)果:1.經(jīng)過(guò)多次劃線分離,獲得一株產(chǎn)紅色色素細(xì)菌。16S rDNA測(cè)序結(jié)果顯示菌株與粘質(zhì)沙雷氏菌具有98%的相似度。使用酸性甲醇提取得到色素粗提取物,經(jīng)柱層析分離得到純化的紅色色素,確定最佳展開劑為石油醚:乙酸乙酯=4:1。薄層色譜對(duì)紅色色素分析,其Rf=0.35。使用可見光光度計(jì)掃描400-700 nm波長(zhǎng),圖譜顯示色素的最大吸收峰在535 nm。使用FTIR分析紅色色素,結(jié)果表明色素的主要吸收波數(shù)為3436 cm~(-1)、2860 cm~(-1)、2924 cm~(-1)和1628 cm~(-1)。使用LC-MS分析,圖譜顯示主要離子峰為324.5 m/z和325.5 m/z。分析結(jié)果與已知靈菌紅素結(jié)構(gòu)特征對(duì)比,認(rèn)定紅色色素為靈菌紅素。據(jù)此,獲得了一株產(chǎn)靈菌紅素的粘質(zhì)沙雷氏菌。2.用設(shè)計(jì)的引物分別擴(kuò)增出合成酶pigF和pigC基因?yàn)?200 bp和2700 bp。將pigF和pigC基因擴(kuò)增產(chǎn)物與pBM20-T載體連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,挑取連接成功的克隆子測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與NCBI比對(duì),結(jié)果顯示pigF和pigC基因與沙雷氏菌FS14的同源性最高。用引物擴(kuò)增出非編碼區(qū)的coa-1基因?yàn)?00 bp。經(jīng)Overlap PCR,將coa-1基因部分序列與pigC和pigF基因拼接,重組為coa-pic和coa-pif基因。然后分別與pBM16A-T載體連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,挑取連接成功的克隆子測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與NCBI比對(duì),結(jié)果顯示coa-1與pigC、pigF序列重組成功,構(gòu)建出pBM16A-coa-pif和pBM16A-coa-pic質(zhì)粒。3.構(gòu)建出的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入粘質(zhì)沙雷氏菌中篩選出重組子S.m-pif和S.m-pic。用SDS-PAGE分析重組子的蛋白表達(dá),電泳結(jié)果顯示重組子都正確表達(dá)出蛋白質(zhì)條帶。通過(guò)比對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)中色素吸光度變化,發(fā)現(xiàn)S.m-pif菌株靈菌紅素產(chǎn)量相比野生菌株提高了6.8%而S.m-pic菌株相比野生菌株提高了17.1%。
【學(xué)位授予單位】：成都理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：Q78;Q93
【圖文】：

e圖 1-1 五種靈菌紅素。a.靈菌紅素，b.十一烷基靈菌紅素，c.間環(huán)庚基靈菌紅素，d.環(huán)烷基靈菌紅素，e. 間環(huán)靈菌紅素1.3.2 靈菌紅素研究進(jìn)展

靈菌紅素合成途徑1.3.2.4靈菌紅素分離純化

2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.3.1 菌株的分離與鑒定菌株形態(tài)如圖2-1所示。菌株在平板上呈現(xiàn)紅色的圓形菌落。菌落中間凸起，邊緣整齊，中心點(diǎn)呈深紅色，邊緣顏色稍淡，表面圓滑，在光照下有光澤，培養(yǎng)過(guò)程中會(huì)散發(fā)出惡臭氣味。平板培養(yǎng) 24 小時(shí)菌斑直徑即可達(dá)約 1mm，延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間可見有紅色色素在瓊脂上擴(kuò)散。在液體培養(yǎng)基上的培養(yǎng)物為深紅色。經(jīng)革蘭氏染色劑染色后，在顯微鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)為桿形，細(xì)胞呈現(xiàn)紅色為革蘭氏陰性菌。圖 2-1 粘質(zhì)沙雷氏菌落2.3.2 16S rDNA 序列分析菌株 16S rDNA 測(cè)序結(jié)果見附錄 B。將測(cè)序結(jié)果上傳 NCBI 比對(duì)后，結(jié)果顯示分離的菌株屬沙雷氏菌屬。在比對(duì)結(jié)果中隨機(jī)選取 20 株菌株構(gòu)建進(jìn)化樹如圖2-2（菌種名前面為登錄號(hào)）。從圖 2-2 可知，菌株與 serritia mansecens JCM1239等粘質(zhì)沙雷氏菌種相似度達(dá)到 98%。確定挑取到的菌株為粘質(zhì)沙雷氏菌

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本文編號(hào)：2746037