【摘要】：南極洲位于地球南端,四周被三大洋包圍,與其他大陸隔離,獨特的地理位置造就了其獨特的氣候。酷寒、干燥、烈風和強紫外輻射等制約了陸生植物的生長發(fā)育。苔蘚植物(Bryophyte)是南極大陸主要植被類群。黃酮類化合物是植物體內最大的一類次生代謝物,參與植物生長發(fā)育以及響應非生物脅迫。盡管類黃酮代謝途徑在很多植物中得到了很好的研究,但在高等植物的低等類群中的研究卻很少。目前,地錢查爾酮異構酶、小立碗蘚查爾酮合酶和鈍磷紫背苔黃酮合酶等少數基因被報道。2-酮戊二酸依賴性雙加氧酶(2-oxoglutarate-dependent dioxygenase,2-ODD)是植物基因組中第二大酶家族,參與各種氧合/羥化反應,在植物和動物發(fā)育、轉錄調節(jié)、核酸修飾/修復和次級代謝合成途徑中發(fā)揮重要作用。類黃酮代謝途徑中的2-ODD家族基因也為豐富的黃酮類化合物形成提供保障。本文從南極黃絲瓜蘚(Pohlia nutans)轉錄組中選取了一個高度響應UV-B的基因。生物信息學分析為類黃酮代謝途徑關鍵2-ODD家族基因,命名為PnODDl(Pohlia nutan2 2-ODD1),并對其進行了克隆分析和功能研究。具體結果如下:1.強紫外輻射(UV-B)對南極黃絲瓜蘚與新疆地區(qū)泛生絲瓜蘚的影響本課題組研究發(fā)現(xiàn),與山東地區(qū)的卵蒴絲瓜蘚(Pohlia proligera)相比,南極黃絲瓜蘚對紫外輻射的耐受性高,且這種抗性與黃酮類化合物相關。本文進一步研究了南極黃絲瓜蘚與新疆泛生絲瓜蘚(Pohlia cruda)對紫外輻射響應的差異。UV-B(70μW/cm2)輻射處理12h后,新疆泛生絲瓜蘚植株出現(xiàn)彎曲和蓬亂、葉片皺縮、顏色變暗,部分植株頂端枯死,受損傷嚴重;而南極黃絲瓜蘚僅有顏色變化,生長狀態(tài)較好。與新疆泛生絲瓜蘚相比,UV-B處理后南極黃絲瓜蘚的活性氧自由基和丙二醛含量水平增幅較小,但卻積累了更多的黃酮類化合物。同時,UV-B處理后,兩種抗氧化酶在兩種苔蘚體內活性均顯著提高,但是南極黃絲瓜蘚抗氧化酶的提升幅度小于新疆泛生絲瓜蘚。以上結果表明,南極黃絲瓜蘚對紫外輻射的抗性較新疆泛生絲瓜蘚強,這種抗性主要依賴于體內合成的大量黃酮類物質。2.南極黃絲瓜蘚PnODD1的克隆、表達分析和功能研究從南極黃絲瓜蘚轉錄組中選取了一個高度響應UV-B的基因,對其進行了克隆、表達分析和功能研究。生物信息學分析發(fā)現(xiàn),該基因屬于類黃酮代謝途徑的2-ODD家族成員(PnODD1)。同時,疑是類無色花青素雙加氧酶(LDOX/ANS-like)基因。PnODD1大小為1510 bp,含有一個1050 bp的ORF,編碼346個氨基酸,蛋白分子量為38.4 kDa。多序列比對發(fā)現(xiàn),PnODDl與其它2-ODD超家族基因的序列相似性為39.5-48.9%,具有典型N端保守的DIOX_N結構域和2-OD-FeⅡ_Oxy結構域;另外,與其它2-ODD一樣,存在Fe2+結合位點殘基(His219、Asp221 and His275)和AKG(2-酮戊二酸)結合位點殘基(Tyr204、His219、Asp221、His275、Arg285和Ser287)。通過SWISS-MODEL進行了同源建模,空間結構顯示,PnODD1蛋白由α-螺旋、β-折疊和無規(guī)卷曲三者在中央部位構成一個空腔,即為鐵離子(Fe2+)結合位點。系統(tǒng)進化樹分析發(fā)現(xiàn),PnODD1與其他物種2-ODDs基于保守的結構和序列特征(如氨基酸同源性和保守基序)而共享一個共同的進化祖先;與鈍磷紫背苔FNSI類聚同一分支,表明了二者具有很近的親緣關系。通過生信在線預測以及PEG-CaCl2法介導的瞬時表達載體轉入擬南芥原生質體的實驗,研究了蛋白的亞細胞定位,結果顯示PnODD1主要分布于細胞質膜和細胞質基質。利用RT-qPCR技術分析了PnDD1基因對非生物脅迫的響應。結果表明,PnODD1基因在D-Mannitol、UV-B、鹽脅迫下均顯著上調表達,說明其參與南極黃絲瓜蘚適應環(huán)境脅迫。將PnODD1基因在擬南芥中組成型表達,研究了其生物學功能。正常生長狀態(tài)下,過表達PnODD1對擬南芥的生長發(fā)育沒有影響。過表達PnODD1增強了擬南芥對鹽脅迫的抗性。在125mMNaCl脅迫下,Col-0、AtOE1和AtOE2種子萌發(fā)率分別是46.7%、91.7%和 86.7%;150 mM NaCl 脅迫下 Col-O、AtOE1 和AtOE2種子萌發(fā)率分別是35.0%、71.6%和75.3%;根長研究發(fā)現(xiàn),在125mM或150mMNaCl處理下,過表達PnODD1擬南芥主根均顯著長于野生型擬南芥。同時,過表達PnODD1增強了擬南芥對滲透脅迫的抗性。在0.1 M或0.3 M D-甘露醇處理后,過表達PnODD1擬南芥的種子萌發(fā)率、主根長度、植株鮮重以及側根數目均顯著高于野生型擬南芥。UV-B處理12h后,野生型擬南芥生長受到了明顯的抑制,莖稈細小、葉片蜷皺和葉片表面積變小;過表達PnODD1緩解了UV-B對擬南芥生長的抑制效應。逆境條件會導致植物體內脫落酸(Abscisic acid,ABA)水平急劇升高,其抑制種子萌發(fā),影響植物生長。過表達PnODD1降低了擬南芥對ABA的敏感性。1.0μMABA處理下,AtOE1和AtOE2種子萌發(fā)數分別是93.3%和91.7%,顯著高于野生型的85.3%,過表達系的主根長度約為野生型的1.30倍。擬南芥總黃酮代謝譜分析發(fā)現(xiàn),PnODD1影響了非生物脅迫下擬南芥體內黃酮類化合物的種類和含量。另外,滲透脅迫下,PnODD1通過影響干旱響應基因(P5CS1和AtKIN1)及ABA信號途徑相關基因(AtABF3、AtMYB2、AtRD22和AtDDEB2A)的表達,增強了過表達擬南芥的抗旱性。通過構建原核表達載體,對PnODD1基因進行異源表達并優(yōu)化了表達條件,確定了在誘導溫度16℃、IPTG濃度0.11mM和誘導時間24h條件下重組蛋白表達量最高;利用HLPC進行了重組蛋白與多種底物的產物分析,發(fā)現(xiàn)PnODD1蛋白可以催化柚皮素(Naringenin,NAR)生成新化合物。體外NAR給養(yǎng)實驗發(fā)現(xiàn),過表達PnODD1緩解了NAR對植物生長的抑制作用。綜上所述,PnODD1通過影響擬南芥體內黃酮類化合物含量和脅迫響應相關基因的表達,增強了植株對非生物脅迫的抗性,為揭示苔蘚適應極地環(huán)境的特殊機制提供了重要參考,豐富了南極植物基因資源。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：Q943.2;Q945.78
【圖文】：

物活性氧（Ｒｅａｃｔｉｖｅ邋ｏｘｙｇｅｎ邋ｓｐｅｃｉｅｓ，邋ＲＯＳ）的水平增加，與此同時，植物會誘導合逡逑成體內酚類和黃酮類化合物，以保護機體免受傷害。黃酮類化合物參與植物對生逡逑物和非生物脅迫的響應如圖１－１所示。逡逑植物在生長發(fā)育過程中會遭受昆蟲、線蟲、真菌、原生生物、細菌和病毒的逡逑侵害，這個過程稱為生物脅迫，是農業(yè)上農作物損失的首要問題（Ｂａｓｋａｒ以《／．，逡逑２０１２）。當病原體或害蟲感染植物時，誘導植物黃酮類化合物合成（Ｂａｒｒｙ邋ｅ／邋ａ／．，逡逑２００２；邋Ｇａｌｌｅｔ以ａ／．，邋２００４）。在水稻中，發(fā)現(xiàn)了三種抑制昆蟲消化并有褐飛虱的威懾逡逑作用的黃酮糖苷（Ｈａｒｂｏｍｅ邋ｄａ／．，邋２０００）。煙草中的蘆丁和槲皮素通過抑制害蟲蟲逡逑卵正常發(fā)育，導致害蟲存活率降低�；ㄉ虚纹に睾吞J丁糖苷的含量與煙草粘蟲逡逑（斜紋夜蛾）的死亡率增加有關（Ｍａｌｌｉｋａｒｊｕｎａ＾ａ／．，２００４）。還有學者發(fā)現(xiàn)棉花葉片逡逑表皮組織中的花青素積累會增加機體對野油菜黃單胞菌（沿ｗＡｏｍｏｎａｙ逡逑ｐｖ．邋ｍｏ／ｖａｃｅａｒａｗ）的抗性（Ｋａｎｇａｔｈａｒａｌｉｎｇａｍ邋ｅｆ邋ａ／”邋２００２）。逡逑干旱、強紫外輻射、重金屬超標、高鹽和高低溫等對植物生長造成了脅迫，逡逑這些因素稱為非生物脅迫。當植物暴露于非生物脅迫時

１．３．１類黃酬代謝途徑概述逡逑類黃酮代謝途徑是植物次級代謝系統(tǒng)中研究最多的途徑之一，它也是苯丙烷逡逑代謝途徑的分支。其合成過程和關鍵基因如圖１－２所示。苯丙氨酸在苯丙氨酸裂逡逑解酶邋（Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ邋ａｍｍｏｎｉａ－ｌｙａｓｅ，邋ＰＡＬ）、肉桂酸輕化酶逡逑（Ｃｉｎｎａｍａｔｅ－４－ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ，Ｃ４Ｈ）和邋４－香豆輔酶邋Ａ邋連接酶（４－Ｃｏｕｍａｒｏｙｌ：ＣｏＡ－ｌｉｇａｓｅ，逡逑４ＣＬ）的作用下合成了類黃酮代謝途徑的前體化合物４－香豆酰輔酶Ａ，它與三分逡逑子N!二酰輔酶Ａ在查爾酮合成酶（Ｃｈａｌｃｏｎｅ邋ｓｙｎｔｈａｓｅ，ＣＨＳ，邋ＥＣ２．３．１．７４）催化下進逡逑行縮合，形成中間體－柚皮素查爾酮（Ｖｅｒｖｅｒｉｄｉｓ邋ｅＭ／．，２００７；邋Ｍｉｒａｎｄａ邋Ｗ邋ａ／．，邋２０１２）；逡逑此外，查爾酮還原酶（Ｃｈａｌｃｏｎｅ邋ｒｅｄｕｃｔａｓｅ，邋ＣＨＲ）與ＣＨＳ共同催化產生６＇－脫氧查逡逑爾酮，而后查爾酮異構酶（Ｃｈａｌｃｏｎｅｉｓｏｍｅｒａｓｅ，ＣＨＩ，邋ＥＣ５．５．１．６）催化查爾酮環(huán)化成逡逑相應的（２Ｓ）－黃烷酮（柚皮素）

３．１．１邋ＵＶ－Ｂ處理對苔蘚長勢和總黃酮代謝譜的影響逡逑自１９８０ｓ以來，氟利昂等物質的使用使地球的臭氧層變薄甚至造成空洞，到逡逑達南極大陸的紫外線急劇增多，導致當地植物暴露在強烈的紫外輻射下。課題組逡逑研究發(fā)現(xiàn)，與常溫卵蒴絲瓜蘚ＣＰｏＷ／ａ／？ｒａ／／ｇｅｒａ，來源山東）相比，南極黃絲瓜蘚逡逑具有更強的抗紫外輻射能力（王太林，２０１７）。為了進一步比較南極黃絲瓜蘚與逡逑常溫苔蘚對強紫外輻射的抗性差異，我們選擇了另一種源于新疆的泛生絲瓜蘚逡逑作為對象。分析了高強度ＵＶ－Ｂ處理對兩種苔蘚表觀形態(tài)和黃酮類逡逑化合物代謝譜的影響。逡逑正常培養(yǎng)條件下，兩株苔蘚莖葉體翠綠、莖桿豎直，生長狀態(tài)較好（圖３－１邋ａ逡逑和ｃ）。將兩組材料置于ＵＶ－Ｂ邋（７０邋ｊａＷ／ｃｍ２）轄射箱中處理１２邋ｈ后，新疆泛生絲瓜逡逑蘚植株出現(xiàn)蜷縮、蓬亂的狀態(tài)，頂端葉片干枯、彎曲；而南極黃絲瓜蘚僅植株顏逡逑色略微變黃，生長狀態(tài)較好（圖３－１邋ａ和ｄ）。逡逑Ｃｏｎｔｒｏｌ邐ＵＶ－Ｂ邋（７０邋ｊｉＷ／ｃｍ２）逡逑

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相關碩士學位論文 前2條

1 姚行浩;南極黃絲瓜蘚（Pohlia nutans）2-酮戊二酸依賴性雙加氧酶基因PnODD1在植物抗逆中的作用[D];山東大學;2019年

2 李程程;南極黃絲瓜蘚（Pohlia nutans）對強紫外輻射的響應及其黃烷酮3-羥化酶的功能分析[D];山東大學;2018年

本文編號：2743841