【摘要】：現(xiàn)如今,α-淀粉酶大量用于食品、飼料產(chǎn)業(yè)中,本研究試圖通過優(yōu)化枯草芽孢桿菌表達系統(tǒng)中的信號肽,從而提高淀粉酶產(chǎn)量,解決淀粉酶異源表達中出現(xiàn)的“瓶頸”。另外,隨著人們對酶制劑應用的多元化,希望一個蛋白具有多種酶學特性,使生產(chǎn)成本得到降低,因此開發(fā)多功能組合酶制劑將成為一定的趨勢。在研究淀粉酶的基礎上,通過對木聚糖酶和α-淀粉酶融合蛋白共表達的研究,幫助我們更深刻地了解到共表達系統(tǒng)的作用機制,為今后關于不同酶制劑之間融合蛋白的共表達提供一些有價值的參考。1、本研究以曲霉屬(Aspergillus lacticoffeatus)的α-淀粉酶AmyCBS 101883和瘤胃真菌類(Neocallimastix patriciarum)木聚糖酶XynCDBFV作為主要研究對象,利用Linker Database數(shù)據(jù)庫篩選三條適用于糖苷水解酶類的連接肽,通過基因重疊延伸技術(Splicing by Ovedap Extension,SOE)的手段構建出木聚糖酶與α-淀粉酶的共表達融合蛋白。并將其分別導入大腸桿菌與畢赤酵母中誘導表達。以單一酶Amy-E2和Amy-pGAP為參照,研究其酶學特性。結論如下:在pH適應性與穩(wěn)定性方面:Amy-E2與融合蛋白Xyn-Amy-E2中α-淀粉酶最適pH均為7.5,當pH低于7.0時Amy-E2酶活迅速下降,而Xyn-Amy-E2在pH 4.5-7.5之間其相對剩余酶活仍保持在70%以上,在酸性條件下有較好的適應性。Linker 1連接的融合蛋白,不僅在pH 6.5及pH 7.5的環(huán)境下相對剩余酶活仍保持在95%左右,pH 8.5堿性條件下的適應性也最優(yōu),且使融合蛋白中的α-淀粉酶活性提高了23%。此外,在真核表達系統(tǒng)中,α-淀粉酶的pH適應性均屬中偏堿性,且融合蛋白α-淀粉酶在酸性條件下優(yōu)于參照酶。在溫度適應性與穩(wěn)定性方面:Xyn-Amy-E2熱穩(wěn)定性最優(yōu),耐受處理50 min后接近半衰期。融合蛋白Xyn-L2-Amy-pGAP和Xyn-L3-Amy-pGAP在55-70℃范圍內(nèi)有很好的適應性,相對剩余酶活在65%以上,優(yōu)于參照酶Amy-pGAP。通過以上融合表達發(fā)現(xiàn):在同一表達系統(tǒng)中,融合后表達的α-淀粉酶活性均低于單一α-淀粉酶。Xyn-Amy、Xyn-L1-Amy、Xyn-L2-Amy、Xyn-L3-Amy分別下降了36.9%、21.6%、59.0%、39.0%。當引入連接肽Linker 1時,使融合α-淀粉酶活性提高了23%。大腸桿菌中α-淀粉酶的平均酶活為0.571 U/mL,真核系統(tǒng)中α-淀粉酶的活性為4.208 U/mL。2、本研究以枯草芽胞桿菌表達系統(tǒng)pBE-S為骨架,構建來源于解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)α-淀粉酶基因(DL-3-4-1)的混合信號肽篩選文庫。通過電轉化的方法轉入到枯草芽孢桿菌(B.subtilis)菌株RIK1285中。基于96孔板微量培養(yǎng),對1920株菌株的發(fā)酵液上清進行檢測,對酶活位于前100的菌株進行測序。經(jīng)篩選獲得14條優(yōu)化表達的信號肽:yomL、PhrA、PhrF、YvbX、YoqH、mpr、YuaB、YqxI、YjcM、ywoF、PhrK、peI、YceG、YddT、yobb。其中,引導α-淀粉酶最高效分泌的信號肽yomL,酶活為113.251 U/mL。進一步對其酶學性質(zhì)進行分析如下:最適pH為6.5,且在中偏堿性條件下的穩(wěn)定性較好,最適溫度為65℃。在65℃、70℃、80℃條件下耐受1 h,其半衰期依次為80 min、70 min、40 min,表明其熱穩(wěn)定性較強。其中Triton x-100、Mn~(2+)、EDTA、Ni~(2+)、Co~(2+)對DL-3-4-1有激活作用;SDS、Al ~(3+)、Cu~(2+)對該酶有一定抑制作用;Ag~+、β-mercaptoethanol對該酶完全抑制。此外,該酶對來自植物種子、根莖類的粗淀粉均有很好的水解作用,有較為廣泛的運用價值。
【學位授予單位】：云南師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：Q78;Q55
【圖文】：

第 1 章 緒論淀粉。（2）Englyst 等[5]依據(jù)淀粉的生物可利用性，將淀粉分成 3 類：快速消化型淀粉（ReadyDi-gestible Starch,RDS）、緩慢消化型淀粉（SlowlyDigestibleStarch,SDS）和抗性淀粉（Resistant Starch, RS）。（3）根據(jù)淀粉的結構可分為直鏈淀粉和支鏈淀粉。不同植物來源的淀粉中直鏈淀粉和支鏈淀粉所含的比例差異較大，一般直鏈淀粉約占 10%-30%，支鏈淀粉約占 70%-90%[6]。在植物生長代謝過程中，不同植物的直鏈淀粉和支鏈淀粉與一些脂類結合，以復雜的組織形式，圍繞中心由內(nèi)向外，形成大小、形狀和結構都不同的淀粉粒，儲存于根莖、種子和果實的細胞組織里[7]。1.1.2 淀粉的分子及結構特點

由一個 β-折疊與 DomainA 相連。如圖（1.2）為來自真菌米曲酶 Taka-amylase（TAA），是第一個被確定三維空間結構的 α-淀粉酶，它具有典型的（β/α）8 TIM 桶狀結構[26]，因此成為 α-淀粉酶研究的模式分子。圖（1.1）中（a）是 TAA 的三維結構；（b）是對（β/α）8 -barre fold α-螺旋與 β-折疊相對位置的解析。在 α-淀粉酶的結構基礎上再分析其酶作用的機制，如下：淀粉酶的催化活性中心由（β/α）8 TIM 桶狀結構構成，即由 N-端肽鏈形成交替排列的各八個 β-折疊和 α-螺旋，在空間上八個 β-折疊排列在內(nèi)，八個 α-螺旋圍繞在外，形成一個中空的（β/α）8 桶狀結構（TIM-barre），此結構為 α-淀粉酶分子的結構域 A（DomainA）；在 β3 與 α3 之間有一段長約 70 個氨基酸殘基，形成了結構域 B（Domain B）呈 β-折疊，其中包含 Ca2+離子結合位點[27]；C-端為 DomainC。β4 的天冬氨酸（Aspartate）、β5 的谷氨酸（Glutamate）、β7的天冬氨酸（Aspartate）分別作為反應中的親核劑、質(zhì)子供體及輔助，構成酶與底物作用的基礎。在裂解 α-1,4 糖苷鍵的同時，保留產(chǎn)物末端的 α-構型[28,29]。

【參考文獻】

相關期刊論文 前10條

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相關博士學位論文 前1條

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相關碩士學位論文 前1條

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本文編號：2733782