【摘要】：近年來,植物病毒病害在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中給農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量和數(shù)量帶來了巨大損失,其中以馬鈴薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)引起的病毒病害尤為嚴(yán)重。雖然目前對(duì)該病害的基礎(chǔ)研究有所進(jìn)展,市面上也有少數(shù)幾種藥劑能有效地治理該種病害,但其具體的作用機(jī)理尚不清楚,導(dǎo)致研發(fā)針對(duì)該病原體的特效性藥劑難度極大。如何有效地篩選抗PVY藥物是防治馬鈴薯病毒病害的關(guān)鍵問題,因此建立一個(gè)以PVY關(guān)鍵蛋白為潛在靶標(biāo)的藥物篩選模型,尋找高活性的抗PVY藥物,對(duì)防治馬鈴薯病毒病具有重要意義。本論文以原核表達(dá)純化的馬鈴薯Y病毒外殼蛋白(Coat protein,CP)為靶標(biāo),利用等溫量熱滴定法、微量熱泳動(dòng)法、農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和蛋白免疫印跡法研究PVY-CP與抗病毒小分子之間的相互作用,測(cè)得PVY-CP與抗病毒小分子之間的結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)及主要作用形式。以藥物與PVY-CP的作用力為指標(biāo),進(jìn)行離體水平的抗PVY藥物篩選。后續(xù)通過突變體蛋白和活體植株的兩種驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)初步探究藥劑的作用機(jī)理,建立了基于PVY-CP為潛在靶標(biāo)的藥物篩選模型。研究結(jié)果表明,在體外,病毒唑、鹽酸嗎啉胍與PVY-CP均有不同程度的結(jié)合力,其結(jié)離常數(shù)大小為病毒唑(4.56μM)鹽酸嗎啉胍(77.6μM),而氨基寡糖、苯并噻二唑與PVY-CP沒有相互結(jié)合;繼而研究了楊梅素衍生物與PVY-CP的相互作用,結(jié)果表明LP4、LP6、LP9和LP17與PVY-CP均有不同程度的結(jié)合力,其中LP6和LP9與PVY-CP的結(jié)合力比LP4和LP17與PVY-CP的結(jié)合力強(qiáng)。通過突變體蛋白的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)明確了病毒唑與PVY-CP的結(jié)合位點(diǎn)為精氨酸(R)153、精氨酸(R)179、天冬氨酸(D)197和賴氨酸(K)217。通過活體驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明了病毒唑?qū)VY-CP在活體植株內(nèi)的表達(dá)有抑制作用。
【學(xué)位授予單位】：貴州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S432.41
【圖文】：

實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線

4.1 pET28a-PVY-CP(wt)重組載體的酶切驗(yàn)證道 1:pET28a-PVY-CP(wt) 重組載體雙酶切；pET28a-PVY-CP(wt) recombinant vector digestLine 1, pET28a-PVY-CP(wt)plasmids were digrs negative control. 1 和泳道 2 可以看出，雙酶切后產(chǎn)生了帶，可以看出說明 pET28a-PVY-CP(wY-CP(wt)重組載體的測(cè)序鑒定重組成功的重組質(zhì)粒送到上海生工生結(jié)果與 NCBI 中已經(jīng)提交的序列進(jìn)行比列與其他已提交的基因序列（GenBank（圖 4.2）。所有結(jié)果均可證明，構(gòu)建的

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本文編號(hào)：2732237