【摘要】：研究背景哺乳動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central Nervous System,CNS)損傷之后,自身修復和再生能力非常有限,給哺乳類動物帶來沉重打擊,會直接造成自身運動和(或)感覺功能的障礙,甚至產(chǎn)生致命的后果,目前還沒有有效的治療手段,本研究旨在從一個方面為哺乳動物的CNS損傷后自身修復和再生能力提供新思路。CNS損傷后之所以自身修復和再生能力極差,其中一個很重要的原因就是膠質(zhì)細胞增生最終導致膠質(zhì)瘢痕的形成,它成為了神經(jīng)自身修復和再生的一道機械屏障。神經(jīng)膠質(zhì)細胞成熟因子β(Glial cell Maturation Factor β,GMFB)在物種間高度保守,但功能不明確。國內(nèi)外對GMFB的研究,發(fā)現(xiàn)其主要在哺乳動物的星形膠質(zhì)細胞和部分神經(jīng)元中表達,促進神經(jīng)細胞生長分化,有報道在低溫腦損傷、乙醇損傷后,GMFB在腦星形膠質(zhì)細胞中表達上調(diào),此外,還有報道GMFB還參與了帕金森病以及自身免疫性疾病的病理過程,但具體機制不清楚。因此對GMFB功能的研究,將為哺乳動物中樞神經(jīng)的再生機理研究提供重要的思路。接觸蛋白(contactin-l,CNTN-l)是免疫球蛋白超級家族接觸蛋白亞組的成員之一,在各種不同的神經(jīng)組織中差異表達,主要存在于細胞漿,已有文獻表明,CNTN-1主要功能有:促進神經(jīng)軸突的生長,影響神經(jīng)元纖維方向;CNTN-1突變型小鼠的小腦體積縮小25%,神經(jīng)元的平行纖維方向紊亂,同時伴有嚴重的運動功能缺陷,如共濟失調(diào)。大腦發(fā)育早期,CNTN-1可以促進腦室下區(qū)的神經(jīng)前體細胞增殖;在肺腺癌細胞中研究也表明,CNTN-1對于侵襲功能和細胞肌動蛋白的骨架重塑以及局部粘附結構是必需的。CNTN-1這些研究報道與我們在斑馬魚中發(fā)現(xiàn)的GMFB缺失后端腦神經(jīng)纖維絲變粗、變短和缺乏方向性有一定的聯(lián)系,提示兩者在腦中功能相似,可能共同參與了神經(jīng)元的增殖、分化和細胞骨架重塑。研究目的明確GMFB與CNTN-1之間有無直接結合及在神經(jīng)功能中的作用。研究方法1.免疫熒光染色和免疫組化染色采用免疫熒光染色技術和免疫組化染色技術,分別觀察GMFB和CNTN-1在小鼠大腦皮層中的表達,以及觀察GMFB和CNTN-1是否存在共表達。2.原代星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng)及鑒定用出生24h的SD乳鼠,在體視顯微鏡下操作,取出腦組織置于培養(yǎng)基上,用顯微鑷夾去小腦,再小心撕去軟腦膜,剔除小血點和海馬。將腦組織剪碎,過濾,最后置于培養(yǎng)基中,37℃,5%CO2培養(yǎng)箱環(huán)境中培養(yǎng)原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細胞,4周成熟后,純度鑒定通過GFAP免疫熒光染色,陽性率達到95%,滿足實驗要求,備用。3.免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)使用BeaverBeadsTM Protein A(or A/G)免疫沉淀磁珠及試劑盒(Beaver,蘇州),抗原樣品制備,磁珠預處理后與抗體工作液混合,進行抗體結合反應;再加入制備好抗原標本進行抗原沉淀反應;最后進行抗原洗脫,進行磁性分離,收集上清液,然后通過SDS-PAGE進行檢測蛋白質(zhì)復合物。4.質(zhì)譜分析(Mass Spectrometry,MS)我們通過免疫共沉淀技術,將與GMFB抗體結合的沉淀物即蛋白復合物,進行質(zhì)譜分析,發(fā)現(xiàn)與GMFB共同沉淀的具體蛋白質(zhì),并進行分析。5.CRISPR/Cas9技術采用CRISPR/Cas9技術,制備敲除GMFB基因小鼠,為研究哺乳動物GMFB作用機制奠定基礎。6.普通PCR采用Premix Taq,TM試劑盒(TAKARA)將提取的DNA進行PCR,將PCR產(chǎn)物跑瓊脂糖凝膠電泳,最后在凝膠成像分析系統(tǒng)下拍照讀取結果,鑒定小鼠的基因型。7.實時熒光定量PCR采用Trizol試劑盒(TAKARA)從大腦組織中提總RNA;采用Prime Script TM試劑盒(TAKARA)將提取的總RNA通過逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA;采用SYBR(?)Premix EXTaq TM試劑盒(TAKARA)定量檢測GMFB和CNTN-1 的相對表達水平,以GAPDH作為參照。8.Western Blot采用RIPA緩沖液(凱基生物,南京)從小鼠大腦組織標本中提取總蛋白,通過SDS-PAGE蛋白電泳,孵育GMFB和CNTN-1抗體,檢測GMFB和CNTN-1的表達情況。9.Morris水迷宮實驗分別設計了航行定位實驗和空間搜索實驗,通過分析逃避潛伏時間和小鼠在平臺象限停留時間,評估野生型組和敲除組小鼠的空間學習和記憶能力。10.高架十字迷宮實驗通過高架十字迷宮實驗,分析小鼠進入開放臂的次數(shù)(open arm entry,OE)和小鼠在開放臂停留時間(openarmtime,OT),評估小鼠情緒焦慮反應。研究結果1.GMFB和CNTN-1在小鼠大腦皮層細胞質(zhì)中共表達我們分別在組織水平和細胞水平采用了免疫組化染色和免疫熒光染色,首先觀察了小鼠大腦皮層中GMFB和CNTN-1的表達;然后通過培養(yǎng)原代星形膠質(zhì)細胞,觀察GMFB和CNTN-1在星形膠質(zhì)細胞中的表達。結果提示GMFB在細胞核和細胞質(zhì)均有表達;CNTN-1在細胞質(zhì)中表達;GMFB和CNTN-1在細胞質(zhì)有共表達。2.GMFB和CNTN-1存在相互作用我們通過免疫共沉淀技術,將與GMFB抗體結合的沉淀物,首先進行考馬斯亮藍染色,發(fā)現(xiàn)了有新蛋白復合物的存在,然后將GMFB沉淀物進行質(zhì)譜分析,我們發(fā)現(xiàn)在小鼠大腦內(nèi),與GMFB共同沉淀的蛋白包括:肌動蛋白(actin),微管(tubulin),和CNTN-1。綜上,GMFB與CNTN-1之間存在相互作用。3.pENTER-GMFB質(zhì)粒和pcDNA3.1-CNTN-1-myc-His(-)質(zhì)粒的構建首先提取小鼠大腦組織的總RNA,經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,用特異性引物進行序列擴增,再用相應酶切空質(zhì)粒和序列,然后結合,轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中,經(jīng)PCR法、酶切法檢測后,挑取陽性克隆測序,測序正確的命名。成功構建了pENTER-GMFB質(zhì)粒和pcDNA3.1-CNTN-1-myc-His(-)質(zhì)粒。4.GMFB基因敲除小鼠的成功制備采用CRISPR/Cas9技術,再通過對PCR產(chǎn)物大小的檢測,鑒定小鼠的基因型。成功獲得GMFB(-/-)小鼠5只,GMFB(+/-)小鼠13只。5.GMFB基因敲除小鼠空間學習、記憶能力和焦慮情緒反應無明顯變化通過Morris水迷宮和高架十字水迷宮實驗發(fā)現(xiàn)GMFB基因敲除小鼠空間學習、記憶能力和焦慮情緒反應無明顯變化。結論本研究明確了 GMFB與CNTN-1在小鼠大腦皮層細胞質(zhì)中共表達,并存在相互作用;GMFB敲基因小鼠的成功制備;GMFB基因敲除小鼠空間學習、記憶能力和焦慮情緒反應無明顯變化。
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：Q42
【圖文】：

圖１．２．４ａ實驗中小鼠編號原則逡逑Ｆｉｇ．ｌ．２．４ａ邋Ｔｈｅ邋ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ邋ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ邋ｏｆ邋ｍｉｃｅ邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ逡逑ＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９邋技術逡逑用ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術（圖１．２．４ｂ），利用非同源重組修復引入突變ＧＭＦＢ基因蛋白讀碼框移碼，功能缺失。通過體外轉(zhuǎn)錄的方式，獲Ａ和ｇＲＮＡ；將Ｃａｓ９邋ｍＲＮＡ和ｇＲＮＡ顯微注射到Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ小鼠的得代小鼠。經(jīng)ＰＣＲ產(chǎn)物測序確認，共獲得９只目的基因蛋白Ｈ）代小鼠；Ｆ０代小鼠與Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ小鼠交配獲得２個品系，共計７小鼠。Ｆ１代小鼠子自交獲得Ｆ２代小鼠，共１個品系，經(jīng)ＰＣＲ產(chǎn)證，其中陽性雜合子小鼠１３只，陽性純合子小鼠５只。逡逑

邐頌士學位論文邐逡逑結果逡逑２．１邐ＧＭＦＢ和ＣＮＴＮ－１在小鼠大腦皮層細胞質(zhì)中共表達逡逑我們分別在組織水平和細胞水平采用了免疫熒光染色技術和免疫組化技術逡逑染色，首先觀察了小鼠大腦皮層中ＧＭＦＢ和ＣＮＴＮ－１的表達；然后通過培養(yǎng)原逡逑代星形膠質(zhì)細胞，觀察ＧＭＦＢ和ＣＮＴＮ－１在星形膠質(zhì)細胞中的表達。逡逑２．１．１邐ＧＦＶ１ＦＢ在細胞核和細胞質(zhì)中均有表達逡逑分別通過免疫熒光染色（圖２．１．１ａ）和免疫組化染色（圖２．１．１ｂ），觀察ＧＭＦＢ逡逑在小鼠大腦皮層中的表達，結果提示ＧＭＦＢ在胞核和胞質(zhì)中均有表達（圖逡逑２．１．１ａ，ｂ）邋0逡逑

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本文編號：2728814