【摘要】：β-半乳聚糖酶是一類以半乳聚糖和阿拉伯半乳聚糖為底物,特異性水解半乳糖殘基間糖苷鍵的糖苷酶,主要包括β-1,3-、β-1,4-和β-1,6-半乳聚糖酶。β-半乳聚糖酶在多糖結(jié)構(gòu)解析、構(gòu)建藥用植物指紋圖譜、制備低聚半乳糖和食品品質(zhì)改良等方面具有廣泛應(yīng)用。其中,β-半乳聚糖酶對(duì)于富含β-半乳糖的阿拉伯半乳聚糖等多糖的結(jié)構(gòu)解析至關(guān)重要。阿拉伯半乳聚糖是一種具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化和神經(jīng)保護(hù)等多種生理活性的多糖,具有廣闊的應(yīng)用前景。分析阿拉伯半乳聚糖的精細(xì)結(jié)構(gòu),有利于其構(gòu)效關(guān)系的研究和深度開發(fā)應(yīng)用。本文對(duì)一種來(lái)源于草酸青霉的外切-β-1,3-半乳聚糖酶進(jìn)行了重組構(gòu)建、酶學(xué)性質(zhì)和功能的研究,為阿拉伯半乳聚糖精細(xì)結(jié)構(gòu)的研究奠定了基礎(chǔ)。論文主要研究結(jié)果如下:制備和純化了重組目的蛋白PoGal3。成功構(gòu)建了Rosetta-pet32a(+)-pogal3重組大腸桿菌菌株和GS115-pPICZαA-pogal3重組畢赤酵母菌株,在重組畢赤酵母菌株中,外切-β-1,3-半乳聚糖酶PoGal3成功表達(dá)。利用硫酸銨沉淀和凝膠過(guò)濾層析從400 mL菌液上清中成功純化出1.2 mg PoGal3。對(duì)重組畢赤酵母菌株的誘導(dǎo)培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化,確定了BMMY誘導(dǎo)培養(yǎng)基pH為6.0,當(dāng)菌液OD_(600 nm)達(dá)到1.0時(shí)開始誘導(dǎo),甲醇加入量為2.0%(v/v),誘導(dǎo)時(shí)間為2 d的誘導(dǎo)培養(yǎng)方案,使蛋白表達(dá)量增加到原來(lái)的3.3倍。PoGal3由451個(gè)氨基酸組成,分子量為48.5 KD,等電點(diǎn)為6.60,是一種穩(wěn)定性較高的親水性蛋白。對(duì)PoGal3的酶學(xué)性質(zhì)和功能進(jìn)行了研究。首先,通過(guò)高碘酸氧化和Smith降解制備了均一性好、含有少量側(cè)鏈結(jié)構(gòu)且純度較高的1,3-β-半乳聚糖AG-P-I。然后,以AG-P-I為底物測(cè)得PoGal3f粗酶的比酶活為9.3±0.9 U/mg,PoGal3f純酶的比酶活為50±3.7U/mg。PoGal3的酶學(xué)性質(zhì)研究結(jié)果表明:PoGal3的最適反應(yīng)溫度為40°C,最適pH為5.0,Zn~(2+)的存在可以使PoGal3的酶活增強(qiáng)到原來(lái)的128.6%,Li~+、Mg~(2+)、Cu~(2+)、Fe~(3+)、Hg~(2+)、Mn~(2+)、Ni~+、EDTA和SDS都會(huì)使酶活力減弱。底物專一性研究結(jié)果表明:PoGal3主要具有β-1,3-半乳聚糖酶活力,也具有一定的β-1,3-葡聚糖酶活力,不能降解1,4/6-β-半乳聚糖、1,4/6-β-葡聚糖、木聚糖和阿拉伯聚糖等。利用PoGal3對(duì)AG-P-I以及兩種經(jīng)典的II型阿拉伯半乳聚糖(LWAG和Acacia)進(jìn)行酶解分析,結(jié)果表明,PoGal3能夠通過(guò)外切作用降解分子量較小的II型阿拉伯半乳聚糖,有潛力成為阿拉伯半乳聚糖結(jié)構(gòu)分析的工具。
【圖文】：

]等從葉下珠中制備了酸性阿拉伯半乳聚糖，，經(jīng)甲基化分析和 NM乳聚糖為主鏈，在半乳糖殘基的 C3/C6 位和非還原末端檢測(cè)到木種單糖的存在。來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)于阿拉伯半乳聚糖的分類較為一致。從結(jié)構(gòu)特點(diǎn)出聚糖分為三類，分別命名為 I 型（AGI）、II 型（AGII）和 III 的結(jié)構(gòu)模型如圖 1-1，它是以 1,4-β-半乳聚糖為主鏈，某些半乳被 1,5-Araf，有時(shí)也被有糖醛酸，鼠李糖等單糖取代。AGI 通常子和葉片中。AGII 是以 1,3-β-半乳聚糖為主鏈，伴隨有 1f 的支鏈取代的結(jié)構(gòu)，最常見的兩種結(jié)構(gòu)模型來(lái)自于阿拉伯樹膠半乳聚糖 LWAG，如圖 1-2 和 1-3，二者最大的區(qū)別在于，前者構(gòu)相對(duì)更復(fù)雜。AGII 是最常見的阿拉伯半乳聚糖類型，在松柏滲出液、果實(shí)、種子、根以及離體培養(yǎng)的細(xì)胞中都能獲得，對(duì)于多。AGIII 是目前了解較少的一類，其結(jié)構(gòu)模型見圖 1-4，是以各拉伯半乳聚糖側(cè)鏈的一類結(jié)構(gòu)。

圖 1-2 以阿拉伯樹膠 Acacia 結(jié)構(gòu)為例的 AGII 結(jié)構(gòu)模型（R 基可能為 t-Rhap、1,3-β-Galp、t-Araf 或 1,3-α-Araf）? 3)Galp(1? 3)Galp(1? 3)Galp(1? 3)Galp(1? 3)Galp(1?6?1Galp6?1Galp6?6?1Araf3?1Arap6?1Galpn?1Araf-3 以落葉松阿拉伯半乳聚糖 LWAG 結(jié)構(gòu)為例的 AGII 結(jié)構(gòu)模
【學(xué)位授予單位】：東北師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：Q55;Q78

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本文編號(hào)：2698897