【摘要】：自然界中,光合作用是萬物生長的能量來源,它能利用太陽能將無機物轉(zhuǎn)變?yōu)橛袡C物,為生物體代謝所使用。本實驗室前期獲得了一個水稻高光效nrpc1(negative regulator of photosynthesis and chloroplast development 1)的突變體,該突變體的葉、穗都呈現(xiàn)出深綠表型,光合效率增強,對該基因的機制已經(jīng)有一定的研究基礎(chǔ)。利用同源比對,從擬南芥中擴增得到了NRPC1基因的同源基因AtNRPC1,然后購買了相應(yīng)的突變體與過表達轉(zhuǎn)基因株系。將獲得的突變體及過表達植株進行鑒定從而獲得純合的突變體和高表達的過表達株系,然后將其作為本實驗的研究材料。本實驗中主要利用葉綠素含量測定、光合速率測定、原生質(zhì)體觀察、葉綠體亞顯微結(jié)構(gòu)觀察、酵母雙雜互作分析、雙熒光素酶報告系統(tǒng)分析、RNA-seq分析、Western-Blot等實驗技術(shù),對AtNRPC1基因的功能進行探究。結(jié)果如下:(1)atnrpc1突變體、野生型Col-0、過表達植株AtNRPC1-OE蓮座葉中,atnrpc1的葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量均顯著升高,均提高約40%;AtNRPC1-OE過表達株系的葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量均顯著降低;在角果中存在相同現(xiàn)象,atnrpc1的葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量均顯著升高;AtNRPC1-OE過表達株系的葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量較Col-0均顯著降低。(2)光系統(tǒng)Ⅱ的最大光化學效率(Fv/Fm)、凈光合速率(Pn)的測定,atnrpc1的Fv/Fm、Pn均較Col-0提高了分別為2.7%、21%;AtNRPC1-OE過表達株系的的Fv/Fm、Pn均較Col-0降低了分別為3.4%、30%。(3)提取生長三周的atnrpc1、Col-0、AtNRPC1-OE植株葉片原生質(zhì)體進行觀察,atnrpc1的葉綠體較Col-0大,而AtNRPC1-OE的葉綠體較Col-0小;同時取三個植株的蓮座葉進行電鏡切片觀察葉綠體的亞顯微結(jié)構(gòu),突變體atnrpc1中葉綠體分布較密集,葉綠體形態(tài)較大且類囊體垛疊成基粒,葉綠體結(jié)構(gòu)較發(fā)達;過表達AtNRPC1-OE中葉綠體個體最小且內(nèi)囊體堆集較薄,基粒片層化。(4)對生物量鮮重、生物量干重、角果數(shù)量、千粒重進行測定,atnrpc1中以上指標均較Col-0顯著增加,達到36%、47%、16%、11%;AtNRPC1-OE中以上指標均較Col-0顯著降低。(5)對atnrpc1、Col-0、AtNRPC1-OE植株進行抽薹天數(shù)統(tǒng)計,atnrpc1的抽薹時間增加,較Col-0延遲兩天,AtNRPC1-OE的抽薹時間減少,較Col-0提前三天。(6)對AtNRPC1基因的組織特異性表達進行分析,其主要在蓮座葉、莖生葉以及角果中表達,在其它組織中表達量較低甚至不表達;同時該基因的表達還受到光周期的影響,且在光照6h時達到峰值。(7)AtNRPC1基因亞細胞定位主要在細胞核以及細胞質(zhì)中表達。(8)水稻中已經(jīng)通過酵母文庫篩出NRPC1的互作蛋白GLKs,為了分析AtNRPC1與AtGLKs是否存在互作關(guān)系,構(gòu)建酵母雙雜載體。AtNRPC1與AtGLKs存在互作關(guān)系,但是AtNRPC1與AtGLK2的互作較弱。(9)在擬南芥原生質(zhì)體中利用雙熒光素酶系統(tǒng)檢測AtGLK1、AtGLK2、AtNRPC1轉(zhuǎn)錄因子對光合相關(guān)基因啟動子的調(diào)控作用,發(fā)現(xiàn)AtNRPC1能夠抑制AtGLK1對光合相關(guān)基因啟動子Lhcb2、Chl27的轉(zhuǎn)錄活性。(10)利用RNA-seq技術(shù)對AtNRPC1下游基因進行分析,擬對atnrpc1、Col-0、AtNRPC1-OE的共有差異基因進行篩選,篩出上調(diào)或下調(diào)基因共115個,通過GO分析及KEGG分析篩出開花相關(guān)基因(例如AG、FLC、SPL15等)及葉綠素代謝相關(guān)基因。(11)對部分光合及葉綠素合成相關(guān)基因表達量進行驗證,結(jié)合Western-Blot結(jié)果,得到Lhca1、Lhcb2、PsaD、POR等在atnrpc1中的表達量較野生型顯著性增加,蛋白水平結(jié)果一致;在AtNRPC1-OE中以上基因表達量均較野生型顯著性下降,蛋白水平結(jié)果一致。(12)對上述RNA-seq篩選到的開花基因進行驗證,得到AG、FLC、AGL42、SPL15、SEP1、TCP1共6個開花相關(guān)基因符合實驗中過表達植株開花提前的現(xiàn)象。(13)構(gòu)建AtGLKs-OE/Col-0、AtGLKs-OE/AtNRPC1-OE轉(zhuǎn)基因植株,AtGLK1-OE/Col-0以及AtGLK1-OE/AtNRPC1-OE的開花時間與對照相比均延長。綜上所述,AtNRPC1基因突變,導(dǎo)致下游光合相關(guān)基因的表達量及蛋白積累量發(fā)生顯著變化,同時葉綠體發(fā)育也受到影響。同時AtNRPC1基因?qū)ǖ陌l(fā)育過程也存在影響。這些結(jié)果對研究AtNRPC1基因的分子機理及植物的高光效奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

圖 1.1：葉綠素 a 合成機理圖[21]Fig1.1: Chlorophyll a synthesis mechanism diagram2.1.2 葉綠素循環(huán)在葉綠素 b 的形成上，主要進行的是原脫植基葉綠素 a 向原脫植基葉綠素 b轉(zhuǎn)變，也有一部分葉綠素 b，是葉綠素 a 在葉綠素 a 加氧酶（CAO）的催化下接發(fā)生轉(zhuǎn)變的。葉綠素 b 也能在葉綠素 b 還原酶（CBR）、羥基葉綠素 a 還原（HAR）催化下再次轉(zhuǎn)變?yōu)槿~綠素 a。此后的研究發(fā)現(xiàn)葉綠素 b 還原酶是兩種同的短鏈，分別稱為 NON-YELLOW COLORING1（NYC1）和 NYC1-LIKENOL），這兩種蛋白以異聚肽的形式形成復(fù)合物，催化葉綠素 b 還原。這種原植基葉綠素 a 與原脫植基葉綠素 b，或葉綠素 a 與葉綠素 b 的互相轉(zhuǎn)變，稱為綠素循環(huán)[27,28],如圖 1.2 所示:

圖 1.2 葉綠素的循環(huán)[28]Fig1.2 Chlorophyll cycle1.2.1.3 葉綠素的降解葉綠素降解機理因其所處環(huán)境的不同而異，長時間受光輻射、黑暗誘導(dǎo)、組織衰敗、果實成熟、逆境脅迫等均會引起葉綠素降解。在葉片衰老過程中葉綠素不斷分解, 導(dǎo)致葉綠素和類胡蘿卜素的比例發(fā)生變化而使葉片呈現(xiàn)出黃色,。葉綠素的降解可以大致分為兩個部分：（1）有色組件轉(zhuǎn)化成初級熒光葉綠素代謝物（pFCC）；（2）pFCC 經(jīng)非酶促異構(gòu)化修飾，轉(zhuǎn)化為非熒光葉綠素分解代謝物（NCC），被運至液泡進一步降解為單吡咯[31,32]。葉綠素 a 在脫鎂螯合酶作用下釋放中心 Mg 原子，，生成脫鎂葉綠素 a。脫鎂葉綠素 a 在脫鎂葉綠素酶（PPH）的催化下脫去植醇，生成脫鎂葉綠酸 a。體外
【學位授予單位】：浙江師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：Q943.2

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本文編號：2669627