【摘要】：作為Homeobox家族中的一員,HOXC10在哺乳動物的細胞分化和胚胎發(fā)育中起著重要的作用。越來越多的證據(jù)表明HOXC10在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有調節(jié)作用,但關于HOXC10基因自身的表達調節(jié)相對被忽略。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)在HOXC10啟動子的反義鏈上存在多個連續(xù)的鳥嘌呤序列,并且利用G-四鏈體預測網(wǎng)站發(fā)現(xiàn)每個多鳥嘌呤序列之間具有較高的形成G-quadreplex(G-四鏈體)結構的潛力。針對有高潛力形成G-四鏈體的區(qū)域利用化學合成方法體外合成該區(qū)域對應的寡核苷酸單鏈,通過圓二色譜實驗分析并確定該區(qū)域存在的多個連續(xù)的鳥嘌呤序列在特定的波長處呈現(xiàn)G-四鏈體結構所展現(xiàn)的特定摩爾橢圓率,明確了 HOXC10啟動子區(qū)域存在G-四鏈體結構。進一步通過非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳展示該區(qū)域在一定濃度的氯化鉀溶液中能夠形成分子內的G-四鏈體結構。將寡核苷酸單鏈用轉染試劑轉入人的宮頸癌HeLa細胞中,用G-四鏈體的抗體BG4做免疫熒光檢測到熒光信號,證實寡核苷酸單鏈在癌細胞自身內環(huán)境中也可以形成G-四鏈體結構。將HOXC10轉錄起始位點上游2 000 bp的核苷酸序列通過PCR方法克隆到高斯熒光素酶報告載體中,并將能夠形成G-四鏈體結構的區(qū)域進行點突變或缺失突變,將不同的報告載體轉染到HeLa細胞中,利用發(fā)光底物檢測高斯熒光素酶表達情況。結果顯示G-四鏈體結構缺失或突變能夠改變HOXC10啟動子下游的高斯螢光素酶表達。據(jù)已報道文獻記載,G-四鏈體結構的打開需要解旋酶的調控,本研究分析了759個乳腺癌病人樣本,發(fā)現(xiàn)具有DNA解旋酶活性的染色質重塑蛋白CHD7與HOXC10基因的表達呈正相關,通過熒光素酶報告載體及CHD7表達干擾實驗發(fā)現(xiàn)解旋酶CHD7能夠解開HOXC10啟動子中的G-四鏈體結構并增強其基因表達。綜上實驗結果,HOXC10啟動子的G-rich區(qū)域能夠形成G-四鏈體結構,并且能夠被解旋酶CHD7解旋進而調控HOXC10基因表達。
【圖文】：

逑三個以上的分子內或分子間的平面四鏈體，每個平面的鳥嘌呤之間通過Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ氫鍵穩(wěn)定逡逑其結構［１７］，其中相鄰鳥嘌呤之間相對大約旋轉９０°邋（圖１）邋［｜８］，中間位置為金屬陽離子，四逡逑周的４個鳥嘌呤之間通過Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ氫鍵連接。一些金屬陽離子緩沖溶液能夠穩(wěn)定Ｇ－四鏈逡逑體結構，其穩(wěn)定性順序為Ｋ＋＞Ｎａ＋＞ＮＨ４＋＞Ｌｉ＋ｔｌ９］。目前研宄者提出多種不同的算法來預測候逡逑選序列形成Ｇ－四鏈體結構的潛能［２（Ｗ３］。在各種生化技術如圓二色譜、ＮＭＲ光譜、非變性聚逡逑丙烯酰胺凝膠電泳等的幫助下，通過化學合成方法將內源性啟動子的鳥嘌呤富集區(qū)合成寡核逡逑苷酸單鏈，證明了邋Ｇ－四鏈體結構可以在體外形成［１７］。逡逑丫＇逡逑）—（／ｈ逡逑ｙＷＨ逡逑Ｈ逡逑圖１邋Ｇ－四鏈體結構平面圖逡逑中間位置為金屬陽離子，四周的４個鳥嘌呤之間通過Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ氫鍵連接。逡逑Ｆｉｇ．邋１邋Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ邋ｏｆ邋Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ逡逑Ｔｈｅ邋ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ邋ｐｏｓｉｔｉｏｎ邋ｉｓ邋ｔｈｅ邋ｍｅｔａｌ邋ｃａｔｉｏｎ，邋ａｎｄ邋ｔｈｅ邋ｆｏｕｒ邋ｇｕａｎｉｎｅｓ邋ａｒｏｕｎｄ邋ｉｔ邋ａｒｅ邋ｃｏｎｎｅｃｔｅｄ邋ｂｙ邋Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ逡逑ｈｙｄｒｏｇｅｎ邋ｂｏｎｄ．逡逑１．２．１邋Ｇ－四鏈體結構的功能逡逑研宄發(fā)現(xiàn)，Ｇ－四鏈體結構廣泛分布于釀酒酵母細胞中和人類基因組上，尤其是在哺乳逡逑動物中許多基因的Ｇ－四鏈體結構區(qū)域是進化保守的［２４￣２６］。并且大數(shù)據(jù)運算發(fā)現(xiàn)，，在人類基逡逑因組上存在的潛在Ｇ－四鏈體結構形成位點超過３０萬個［２５］。這些潛在的Ｇ－四鏈體結構在調逡逑控的關鍵位點分布較多

在基因的啟動子區(qū)域中，Ｇ－四鏈體結構可以在其正義鏈或負義鏈中形成。本研宄檢測逡逑了人類ＨＯＸＣ１０基因的啟動子區(qū)域，發(fā)現(xiàn)在ＨＯＸＣ１０基因臨近轉錄起始位點的啟動子區(qū)域逡逑存在胞嘧啶富集區(qū)，見圖３－１，胞嘧啶富集區(qū)域為紅色部分，而其互補鏈就正好存在著（Ｇ＞逡逑ｓＮ＾ＧｇＮ＾Ｇ＾Ｎ＾Ｇ＾）。將轉錄起始位點上游的第一個核苷酸定義為“－１”時，在－２９５和－逡逑２７２之間存在著連續(xù)４組５個胞嚼啶連續(xù)出現(xiàn)的情況，而其反向互補鏈則存在著連續(xù)４組５逡逑個鳥嘌呤連續(xù)出現(xiàn)的情況
【學位授予單位】：東北林業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：Q75

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本文編號：2659455