發(fā)布時間：2020-05-07 06:46

【摘要】：α-法尼烯是一種倍半萜類揮發(fā)性有機化合物,存在于多種植物的葉片、花和果實中,它在植物防御中扮演著重要角色,同時也與植物的抗冷性、昆蟲的誘導及低溫貯藏的蘋果和梨果實重大的生理代謝紊亂-虎皮病的發(fā)生有關(guān)。法尼烯又是一種優(yōu)良生物燃料法尼烷的前體,近年來受到了人們的廣泛關(guān)注,具有廣闊的市場價值。以往有關(guān)α-法尼烯的研究大多集中在其代謝途徑中關(guān)鍵酶的基因克隆、生物學功能和代謝工程上,而轉(zhuǎn)錄因子對蘋果α-法尼烯生物合成的調(diào)控機制未見報道。本項研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),蘋果中的轉(zhuǎn)錄因子MdMYC2(bHLH轉(zhuǎn)錄因子)和MdERF3(Ethylene response factor 3)能夠激活α-法尼烯合成途徑中最后一步關(guān)鍵酶基因MdAFS的啟動子區(qū)域,上調(diào)MdAFS基因的表達,從而使下游產(chǎn)物α-法尼烯得到積累。主要結(jié)論如下:(1)利用qRT-PCR技術(shù)對MdAFS基因在青香蕉蘋果葉片的激素誘導表達進行分析,發(fā)現(xiàn)MdAFS基因表達受茉莉酸(JA)、乙烯(ETH)、脫落酸(ABA)、水楊酸(SA)激素的調(diào)節(jié)。在常溫和低溫儲藏條件下,利用JA、ETH處理蘋果果實均能促進α-法尼烯的合成,而1-MCP處理則抑制α-法尼烯的合成。(2)利用PlantCARE數(shù)據(jù)庫對MdAFS基因啟動子進行分析預測,發(fā)現(xiàn)啟動子區(qū)域存在多種響應(yīng)植物激素(ETH、JA、ABA)和非生物脅迫的順式作用元件,以及多個MYB、MYC結(jié)合位點。根據(jù)結(jié)合位點的分析,我們篩選到了茉莉酸、乙烯途徑中的重要轉(zhuǎn)錄因子MdMYC2、MdERF3,研究α-法尼烯合成的調(diào)控機制。qRT-PCR分析結(jié)果表明,JA、ETH處理誘導MdMYC2、MdERF3的上調(diào)表達,同時MdAFS也上調(diào)表達,表明MdMYC2、MdERF3與MdAFS基因表達具有相關(guān)性。(3)煙草熒光素酶試驗表明,轉(zhuǎn)錄因子MdMYC2和MdERF3能夠激活MdAFS基因啟動子。酵母單雜交試驗發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)錄因子MdMYC2和MdERF3可以在體外結(jié)合MdAFS基因啟動子。EMSA試驗結(jié)果進一步分析發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)錄因子MdERF3能夠與MdAFS啟動子上的DRE元件直接結(jié)合。在蘋果愈傷組織中分別過表達MdMYC2和MdERF3,MdAFS基因的表達量均升高,而沉默MdMYC2的愈傷組織中,MdAFS基因的表達量降低。(4)利用果實瞬時轉(zhuǎn)化體系在青香蕉蘋果果皮中過量表達轉(zhuǎn)錄因子MdMYC2和MdERF3,GC-MS檢測結(jié)果表明,過表達MdMYC2和MdERF3顯著促進了α-法尼烯的合成。(5)轉(zhuǎn)錄因子MdMYC2和MdERF3還同時影響α-法尼烯合成途徑中的其它關(guān)鍵酶基因HMGR和FPPS的表達,表明轉(zhuǎn)錄因子MdMYC2和MdERF3通過激活α-法尼烯代謝途徑中多個基因的協(xié)同表達,有效地提高α-法尼烯的合成量。
【圖文】：

蘋果轉(zhuǎn)錄因子 MdMYC2 與 MdERF3 對 -法尼烯生物合成的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，并且具有抗癌、消炎等作用，如紫杉醇對卵巢癌和乳腺癌有明wein et al., 2001），青蒿素是治療瘧疾的特效藥。其次，揮發(fā)性的萜類香氣的主要來源，因此被廣泛應(yīng)用于香料、香水、食品及化妝品等行03）。此外，萜類結(jié)構(gòu)的多樣性使得一些萜類化合物近年來被開發(fā)應(yīng)為燃料的前體。萜類化合物作為次生代謝產(chǎn)物不僅具有重要的藥用在生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用（圖 1-1）。首先當植物受到植食性，植物釋放的萜類揮發(fā)物一方面直接驅(qū)除來抵御動物和害蟲的侵害等萜類物質(zhì)能抵抗煙芽夜蛾的活性(姜永幸等，1997)，另一方面它性動物或害蟲的天敵，作為化學信號起到間接防御的作用（McCorm其次，植物產(chǎn)生的萜類物質(zhì)對于傳粉者有顯著吸引作用，從而有利于后代。萜類物質(zhì)還可以保護植物免受病原菌的侵害（Huang et al., 2

圖 1-2 植物中萜類物質(zhì)的合成途徑（Nagegowda, 2010）Fig. 1-2 The pathway of terpeniods biosynthesis in plant (Nagegowda, 2010).3 萜類物質(zhì)代謝工程植物萜類物質(zhì)含量極低，，分子結(jié)構(gòu)較為復雜，化學合成困難且成本高，因此工程的手段提高目標萜類的產(chǎn)量已經(jīng)成為熱點。大腸桿菌和釀酒酵母是進行常見的兩種微生物。與很多萜類相似，β-香樹脂醇在植物中的含量很低，化率不高，因而限制了其規(guī)�；a(chǎn)和廣泛應(yīng)用。有研究在釀酒酵母中構(gòu)建了β-香樹脂醇的合成途徑，并不斷改善發(fā)酵過程，最終使 β-香樹脂醇產(chǎn)量.7±8.62mg/L，與初始工程菌相比提高了 209 倍（張根林，2015）。紫杉醇是一物堿，廣泛應(yīng)用于抗癌藥物中，是一種有效且必需的組成成分。在大腸桿菌中采用代謝途徑工程的多變量模塊化方法，成功的提高了紫杉醇中間體紫杉（Ajikumar et al., 2010）。法尼烯最早從蘋果樹中分離得到（Huelin and Mu6），在植物防御方面起到重要作用。在大腸桿菌菌株中過表達含有甲羥戊酸途
【學位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：Q943.2

【參考文獻】

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本文編號：2652592