發(fā)布時(shí)間：2020-05-03 12:18

【摘要】：糖(碳源)代謝過(guò)程是生物體最重要的代謝過(guò)程,其往往受到嚴(yán)格的信號(hào)調(diào)控。當(dāng)其代謝過(guò)程出現(xiàn)紊亂時(shí),往往導(dǎo)致細(xì)胞不同程度的病變、死亡。釀酒酵母是研究較為深入的真核模式生物,具有食品級(jí)安全、代謝旺盛等特點(diǎn),非常適合作為多種發(fā)酵產(chǎn)品生產(chǎn)的細(xì)胞工廠,深入研究其代謝調(diào)控機(jī)制將有助于開(kāi)發(fā)新的構(gòu)建策略,促進(jìn)其在代謝工程、合成生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。釀酒酵母糖代謝和大部分真核生物一樣,主要包括糖酵解途徑、磷酸戊糖途徑、TCA循環(huán)、乙醛酸循環(huán)和糖異生途徑等;另一方面,其代謝又具有典型的特點(diǎn)。當(dāng)生長(zhǎng)環(huán)境中存在豐富發(fā)酵性碳源(最典型的:葡萄糖)的條件下,無(wú)論供氧充足與否,釀酒酵母細(xì)胞都處于強(qiáng)酵解狀態(tài),只有少量丙酮酸進(jìn)入TCA循環(huán)進(jìn)行呼吸代謝,而大部分生成乙醇。當(dāng)葡萄糖耗盡,酵母通過(guò)級(jí)聯(lián)的信號(hào)途徑做出響應(yīng),從轉(zhuǎn)錄、翻譯、翻譯后蛋白質(zhì)修飾等各個(gè)層面調(diào)節(jié)各大代謝途徑中基因的表達(dá)和蛋白活性,從而精確調(diào)控代謝網(wǎng)絡(luò)轉(zhuǎn)為呼吸代謝模式,利用發(fā)酵葡萄糖時(shí)積累的非發(fā)酵性碳源——乙醇進(jìn)行二次生長(zhǎng)。這種碳源切換引起的蛋白表達(dá)修飾和生理代謝變化過(guò)程涉及生命活動(dòng)最基本的對(duì)環(huán)境營(yíng)養(yǎng)的響應(yīng)和對(duì)自身代謝的調(diào)控,而被科學(xué)家們長(zhǎng)期關(guān)注。目前對(duì)這些過(guò)程涉及的信號(hào)系統(tǒng)以及調(diào)節(jié)機(jī)制主要包括對(duì)細(xì)胞整體代謝酶的轉(zhuǎn)錄調(diào)控和蛋白磷酸化修飾以及相關(guān)的調(diào)控通路和反饋回路,仍然處于有限認(rèn)知的水平。賴(lài)氨酸乙�；羌�(xì)胞內(nèi)一種重要的翻譯后修飾過(guò)程。多年來(lái),相關(guān)研究主要集中在組蛋白乙�；揎棇�(duì)基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)、DNA的復(fù)制和修復(fù)等,關(guān)注的是主要是其表觀遺傳學(xué)意義,也有少部分工作涉及到了代謝等生理特征等表型現(xiàn)象。另一方面,最近的研究發(fā)現(xiàn),除組蛋白外,大量代謝酶蛋白也存在乙酰化位點(diǎn)。基于此,本論文從代謝酶在不同碳源條件下的乙酰化差異和擾動(dòng)乙�；兔撘阴；^(guò)程對(duì)碳代謝的影響兩個(gè)角度,初探在調(diào)控水平乙�；瘜�(duì)釀酒酵母碳代謝的影響。本論文第一部分工作首先利用高分辨質(zhì)譜解析發(fā)酵性碳源葡萄糖以及非發(fā)酵性碳源乙醇這兩種碳源條件下釀酒酵母乙�；M的差異。結(jié)果顯示,在乙醇條件下,糖酵解途徑、戊糖磷酸途徑、核糖體蛋白的乙�；蕉喑尸F(xiàn)下調(diào)趨勢(shì):三羧酸循環(huán)中蛋白乙酰化水平呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)。之后,選擇在不同碳源條件下存在乙酰化差異的代謝途徑蛋白和糖信號(hào)途徑蛋白,利用點(diǎn)突變技術(shù),將乙�；稽c(diǎn)處賴(lài)氨酸突變?yōu)榫彼?使該乙酰化位點(diǎn)成為組成型非乙�；癄顟B(tài)。繼而,通過(guò)生化水平的酶學(xué)測(cè)定,研究具體的乙�；揎椢稽c(diǎn)對(duì)蛋白活性的影響。結(jié)果顯示,分別與對(duì)照相比,丙酮酸激酶(編碼基因PYK1)、蘋(píng)果酸脫氫酶(編碼基因MDH1)、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(編碼基因ZWF1)乙�；稽c(diǎn)突變菌株比酶活分別提高了25.6%、41.4%、27.3%;而果糖1,6-二磷酸醛縮酶(編碼基因FBA1)乙酰化位點(diǎn)突變菌株比酶活降低了 19.9%。上述代謝酶單個(gè)酶活性水平的變化不影響菌株的發(fā)酵特征。但是,乙醇脫氫酶(編碼基因ADH1)乙�；稽c(diǎn)突變后,菌株發(fā)酵葡萄糖時(shí)菌體得率明顯降低,而乙醇得率增加,乙酸明顯積累。這些結(jié)果表明,釀酒酵母中,乙�；瘯�(huì)影響代謝酶活性,某些酶如Adh1突變子能夠顯著影響代謝。多個(gè)酶蛋白乙�；町悗�(lái)的整體調(diào)控效應(yīng)還有待進(jìn)一步論證。課題第二部分通過(guò)敲除乙�；富蛉ヒ阴；傅拇呋瘉喕蛑匾M成亞基,人為擾動(dòng)乙�；^(guò)程并研究了這些擾動(dòng)對(duì)菌株代謝特征的影響。結(jié)果顯示,敲除GCN5、ADA2對(duì)菌體得率沒(méi)有影響,對(duì)葡萄糖利用沒(méi)有促進(jìn)作用,乙醇得率略有增加;敲除NAT3降低了菌體得率,對(duì)葡萄糖利用沒(méi)有促進(jìn)作用,乙醇得率略有增加;敲除HOS2、HST2、SET3、RCO1、SDS3、RPD3沒(méi)有對(duì)葡萄糖的利用和乙醇產(chǎn)生沒(méi)有明顯影響。敲除ARD1、SAS3加快了發(fā)酵代謝階段葡萄糖的利用,降低菌體得率,增加乙醇得率;敲除HAT1(目前酵母中唯一已知的細(xì)胞質(zhì)乙酰基轉(zhuǎn)移酶)能夠加快呼吸代謝階段乙醇的利用。這些結(jié)果表明,乙酰化參與釀酒酵母的細(xì)胞代謝調(diào)控,但具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究�，F(xiàn)有的代謝組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白組、磷酸化組等研究對(duì)釀酒酵母碳代謝的揭示已經(jīng)相對(duì)比較深入,但有關(guān)代謝的調(diào)節(jié)機(jī)制仍有很多未知。近年來(lái),有觀點(diǎn)認(rèn)為乙酰化調(diào)節(jié)細(xì)胞生理代謝具有從細(xì)菌到人類(lèi)的保守性。本論文的研究是有關(guān)蛋白乙酰化調(diào)節(jié)代謝研究的有益補(bǔ)充,具有揭示生物界代謝機(jī)制和支持進(jìn)化觀點(diǎn)的廣泛意義。
【圖文】：

邐山東大學(xué)碩士學(xué)位論文發(fā)酵性碳源時(shí)（圖Ｍ），低葡萄糖水平激活Ｓｎｆｌ激酶，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄的磷酸化和失活，允許基因表達(dá)。Ｃａｔ８，邋Ｓｉｐ４和Ｒｄｓ２也是Ｓｎｆｌ和Ｇｓｍ］（可能）是似的激活劑，其基因產(chǎn)物是參與Ｃａｔ８和合物的一部分。ＣｄｒＳ的表達(dá)可能是自動(dòng)調(diào)節(jié)的。ＣａｔＳ和可能性Ｓｉｐ４的正調(diào)節(jié)劑。Ｃａｔ８，邋Ｓｉｐ４，邋Ｒｄｓ２，邋Ｅｒｔｌ和Ｇｓｍ丨都是編碼關(guān)鍵糖的轉(zhuǎn)錄激活因子。ＣＨＩＰ分析表明，Ｒｄｓ２結(jié)合到ＯＰ／ｉ基因，其謝的ＧＬＴ／和ＧＬＴ２表達(dá)的阻遏物（Ｔｕｒｃｏｔｔｅ邋ｅｔ邋ａＬ邋２０１０）。這些調(diào)交疊．．，形成復(fù)雜、精確的調(diào)控回路（Ｂｒｏａｃｈ，邋２０１２；邋Ｆｅｍａｎｄｅｚ－ＧａｒＫｕｔｔｙｋｒｉｓｈｎａｎ邋ｅｔ邋ａｌ．，２０１０）。逡逑Ｓｎｆ１逡逑ｋｉｎａｓｅ邋ａｃｔｉｖｅ

人類(lèi)癌細(xì)胞系中鑒定出驚人的１．７５０種乙�；鞍踪|(zhì)（Ｃｈｏｕｄｈａｒｙ邋ｅｔ邋ａＬ邋２００９）。乙逡逑�；鞍踪|(zhì)在小鼠和人肝臟中高度保守（Ｚｈａｏ邋ｅｔ邋ａＬ邋２０１０）．但在肝臟和白血病細(xì)逡逑胞之間有很大不同（圖１－３）。幾乎所有參與糖酵解，ＴＣＡ循環(huán)，尿素循環(huán)，脂逡逑肪酸l#化和氮代謝的酶都可能被乙酰化。代謝酶的活性受二個(gè)主要水平控制：酶逡逑的量，催化活性和底物的可接近性�？赡尜�(lài)氨酸乙酰化作為代謝中的主耍調(diào)節(jié)機(jī)逡逑制出現(xiàn)，其涉及控制代謝酶的所有Ｆ個(gè)水平并乜在人類(lèi)疾病中經(jīng)常改變。因此，，逡逑無(wú)論在修飾的底物數(shù)量上看，還足從其促進(jìn)的各種調(diào)節(jié)機(jī)制上Ｃ％乙酰化與細(xì)胞逡逑調(diào)節(jié)中的其他常見(jiàn)翻譯后修飾…樣重要（Ｘｉｏｎｇ邋＆邋Ｇｕａｎ．邋２０１２）。逡逑癌細(xì)胞通過(guò)調(diào)節(jié)代謝酶的轉(zhuǎn)錄或翻譯后修飾（ＰＴＭ）來(lái)實(shí)現(xiàn)代謝重編程逡逑（ＶａｎｄｅｒＨｅｉｄｅｎｅｔａｌ．．邋２００９），例如，丙酮酸激酶（ＰＫ）催化糖酵解的最后一步，逡逑６逡逑
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：Q936

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本文編號(hào)：2647513