【摘要】：納米通道單分子技術是一種高度創(chuàng)新的技術,它廣泛應用于DNA測序、疾病診斷、藥物篩選、環(huán)境監(jiān)測等領域。作為一種具有實時、靈敏、優(yōu)異選擇性和穩(wěn)定性等優(yōu)點的技術,其受到廣泛關注。該項技術的原理是在施加電壓的情況下,分析物被驅(qū)動到納米孔中,從而產(chǎn)生電流信號,通過分析特征電流信號的持續(xù)時間、頻率、振幅等信息可以揭示檢測物的特性。DNA和RNA是生命遺傳物質(zhì),科學家們從來沒有停止關于DNA和RNA的研究。通過深入了解遺傳物質(zhì),對生命科學水平的提升具有重大意義。本文包括兩部分實驗內(nèi)容,首先是研究單鏈DNA(ssDNA)在聚乙二醇(PEG)模擬的擁擠環(huán)境中穿過α-HL納米孔的動態(tài)過程,其次是在單分子水平上研究前體RNA-21(pre-microRNA-21)和多肽相互作用的機理,主要研究內(nèi)容具體如下:1文獻綜述簡要綜述了納米孔單分子檢測技術的研究發(fā)展,檢測原理以及該項技術的應用。2擁擠劑誘導DNA穿過納米孔的研究擁擠的細胞環(huán)境與許多重要的生物過程密切相關。然而,分子擁擠效應對DNA穿孔行為的影響研究較少。我們使用納米孔單分子分析技術來量化PEG存在時ssDNA遷移的熱力學和動力學常數(shù)。結果表明,ssDNA事件的頻率表現(xiàn)出對擁擠劑尺寸大小的非單調(diào)依賴性,而ssDNA事件的頻率和滯留時間隨著擁擠劑濃度的增加而單調(diào)增加。在存在PEG的情況下,ssDNA在納米孔中的遷移速率降低(從20μs/堿基至120μs/堿基),捕獲率提高了118.27倍。有趣的是,20%(w/v)PEG 4k對DNA-α-HL納米孔相互作用的影響最為顯著,此時ssDNA的吉布斯自由能和未加PEG環(huán)境中的ssDNA相差了16.27 kJ mol~(-1)。PEG 4k濃度為40%(w/v)時,ssDNA-α-HL納米孔的平衡結合常數(shù)增加了764.5倍。該研究為擁擠條件下探索單分子動力學提供了強有力的手段,而且納米孔分子擁擠效應將在納米孔生物傳感和迫切需要捕獲分析物和控制遷移的納米孔DNA測序中具有廣泛的應用。3基于α-HL蛋白納米通道對pre-microRNA-21和多肽相互作用的研究Pre-microRNA與小分子的相互作用對調(diào)控microRNA的水平有重要意義。本實驗采用α-HL作為納米通道,通過對比多肽-pre-microRNA-21復合物和單獨的pre-microRNA-21產(chǎn)生的電流響應信號,可以成功觀察到多肽-pre-microRNA-21復合物的滯留時間比pre-microRNA-21的滯留時間增加了大概2倍,從419.50±33.29 ms到828.8±61.61 ms,因此結果表明pre-microRNA-21和多肽小分子發(fā)生了相互作用,導致pre-microRNA-21的結構更加穩(wěn)定,解鏈時間增加。隨后將不同摩爾比的多肽和pre-microRNA-21反應產(chǎn)生的復合物加到納米孔的cis端中,發(fā)現(xiàn)隨著參加反應的多肽和pre-microRNA-21的摩爾比越大,反應得到的pre-microRNA-21-多肽復合物越多,其在納米孔中的長滯留時間的事件越多,平均滯留時間越大,當兩種反應物固定在某一個摩爾比后,復合物事件的平均滯留時間不再增加,此時多肽和pre-microRNA-21的反應已經(jīng)達到了飽和。該實驗為藥物篩選提供了一種新的平臺。
【圖文】：

圖 1.1 納米孔單分子技術檢測原理示意圖。.1.3 納米孔的分類以及 α-HL 納米孔的結構納米孔大致可分為三類：生物納米孔[9-11]、固態(tài)納米孔[12-14]和復雜納米孔[15, 16]。納米孔各有優(yōu)缺點:生物納米孔具有合適的內(nèi)徑以及可重現(xiàn)的自組裝能力，但是它易遭受破壞；固態(tài)納米孔的制備一般是人工合成的，所以是可控的，但是它有強烈音；復雜納米孔是固態(tài)納米孔和生物納米孔的結合，可以充分利用這兩類納米孔的。生物納米孔主要包括 α-溶血素（α-HL）、恥垢分枝桿菌孔蛋白 A（MspA）、phiNA 分子馬達等, 其通常嵌入脂質(zhì)體、脂質(zhì)膜或者聚合物膜中[11, 17]。固態(tài)納米孔包墨烯、三氧化二鋁、碳納米管等。第一個被構建的納米孔是 α-HL 納米孔[18]。α-HL 是從葡萄球菌中分離得到的一肽毒素[19, 20]，可以自組裝嵌入磷脂雙分子層膜中。α-HL 納米孔有不對稱的蘑菇外形

α-HL的結構
【學位授予單位】：西北大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：Q52;TB383.1

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