【摘要】：廣泛分布于植物中的GPRP(Glycine and proline-rich protein)蛋白家族基因已被報(bào)道在植物的生長發(fā)育過程中具有重要的作用。然而,目前很少見對(duì)植物中GPRP蛋白基因功能進(jìn)行深入研究的報(bào)道。本研究以已報(bào)道的、尚未見生物學(xué)功能研究的擬南芥AtGPRP3基因?yàn)檠芯繉?duì)象,在分析該基因基本特點(diǎn)、蛋白進(jìn)化關(guān)系和表達(dá)特性的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步創(chuàng)建了AtGPRP3基因的過量表達(dá)、CRISPR敲除缺失表達(dá)及其功能互補(bǔ)轉(zhuǎn)基因材料,并對(duì)其在擬南芥幼苗生長發(fā)育過程中的作用進(jìn)行了分析,初步發(fā)現(xiàn)AtGPRP3基因影響擬南芥幼苗的生長速率。為深入研究AtGPRP3基因的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:1.擬南芥AtGPRP3基因的基本特點(diǎn)、蛋白進(jìn)化關(guān)系和表達(dá)特征通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),AtGPRP3基因包含2個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子,共編碼179個(gè)氨基酸,蛋白等電點(diǎn)(pI)為9.75,分子量(Mw)為17.8 kDa。蛋白進(jìn)化分析結(jié)果表明,GPRP蛋白家族基因在單子葉和雙子葉中不存在明顯的分化。GUS染色和qRT-PCR結(jié)果顯示,AtGPRP3基因主要在擬南芥的連座葉和莖上葉中的表達(dá)量較高,在成熟的果莢中表達(dá)較少。亞細(xì)胞定位結(jié)果表明,AtGPRP3蛋白主要在細(xì)胞核中表達(dá)。2.AtGPRP3的過量表達(dá)、缺失表達(dá)及其功能互補(bǔ)轉(zhuǎn)基因擬南芥材料創(chuàng)建以pCXSN質(zhì)粒構(gòu)建了AtGPRP3的過量表達(dá)載體,利用Yao.ATU6_35s.HPT和pCAMBIA1300-Myc質(zhì)粒分別構(gòu)建了AtGPRP3的CRISPR敲除缺失表達(dá)突變體及其功能互補(bǔ)轉(zhuǎn)基因遺傳材料,目前已獲得了AtGPRP3基因的過量表達(dá)、CRISPR敲除缺失表達(dá)及其功能互補(bǔ)轉(zhuǎn)基因純合株系各3種類型,用于后續(xù)的功能分析實(shí)驗(yàn)等。3.AtGPRP3影響擬南芥幼苗的生長發(fā)育分別在pH5.8和pH8.0兩種培養(yǎng)基上種植野生型擬南芥、AtGPRP3基因的過量表達(dá)、缺失表達(dá)及其功能互補(bǔ)轉(zhuǎn)基因擬南芥材料,對(duì)各種材料幼苗地上部鮮重進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示:與野生型擬南芥幼苗地上部鮮重相比,AtGPRP3過量表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株幼苗地上部的鮮重顯著減少,AtGPRP3缺失表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株幼苗的地上部鮮重顯著增加,而功能互補(bǔ)轉(zhuǎn)基因植株幼苗地上部鮮重與野生型的差異不顯著。這些結(jié)果表明AtGPRP3對(duì)擬南芥幼苗地上部的鮮重可能具有負(fù)調(diào)控作用,進(jìn)而影響擬南芥苗期的生長速率。4.AtGPRP3互作基因的篩選、鑒定與轉(zhuǎn)基因功能驗(yàn)證在擬南芥幼苗cDNA酵母篩選文庫構(gòu)建和初篩的工作基礎(chǔ)上,進(jìn)一步開展了酵母雙雜(Y_2H)和雙分子熒光互補(bǔ)(BiFC)實(shí)驗(yàn)鑒定等,共獲得了3個(gè)AtGPRP3的互作基因AtCAT2、AtCLC3和AtCYSD1。進(jìn)而利用CRISPR-Cas9技術(shù),重點(diǎn)創(chuàng)建了互作基因AtCAT2的缺失表達(dá)擬南芥轉(zhuǎn)基因突變體,并分別于pH5.8和pH8.0的兩種培養(yǎng)基上種植生長,對(duì)其幼苗地上部鮮重進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明:與野生型擬南芥幼苗地上部鮮重相比,AtCAT2的CRISPR敲除缺失表達(dá)突變體幼苗地上部鮮重顯著降低。這一結(jié)果與AtGPRP3過量表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系的表型類似;由此,我們初步推測:AtGPRP3與AtCAT2結(jié)合對(duì)AtCAT2本身的作用可能具有抑制的效果,但有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。
【圖文】：

圖 1.1 植物向光性過程中光敏色素介導(dǎo)的信號(hào)傳遞示意圖[7]Fig. 1.1 Schematic diagram of phytochrome-mediated signal transmission phototropism物對(duì)應(yīng)的光譜范圍從近紫外（UVB）280~315nm 波長到遠(yuǎn)紅外（F 波長的整個(gè)波段，植物對(duì)光譜的幾個(gè)部分具有各自不同的光感受器，

圖 1.2 生長素感知和傳導(dǎo)信號(hào)的關(guān)鍵組分[1.2 Key components in auxin perception and siA）主要由前體物質(zhì)經(jīng)過草莽酸途徑產(chǎn)生，的前體化合物，包括芳香族氨基酸、生物香代謝物，是類黃酮和原發(fā)性植物次生代草莽酸途徑的最終產(chǎn)物[16]。在植物體內(nèi)，）和 ATP-BINDING CASSETTE B（ABCB生長素通過 AUXIN 1（AUX1）/ LIKE-AU形式通過擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞[18]。Dahlke 等發(fā)現(xiàn)由不同的生長素信號(hào)通路所導(dǎo)致[19]。酸（ABA）由類胡蘿卜素合成，經(jīng) CYP70都可被感知，細(xì)胞溶質(zhì)性 PYR / PYL / RC / PYL / RCAR 受體結(jié)合后會(huì)激活 SnRK2 核中的 ABF /AREB /ABI5 堿性亮氨酸拉鏈而可以調(diào)控眾多的植物生長發(fā)育過程。
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：Q943.2

【相似文獻(xiàn)】

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1 劉曉京;AtGPRP3基因在擬南芥幼苗生長中的功能分析[D];南昌大學(xué);2019年

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本文編號(hào)：2639081