發(fā)布時間：2020-04-24 10:42

【摘要】：線蟲每年對農(nóng)作物造成相當大的損失,由于傳統(tǒng)的防治線蟲措施與噴灑化學農(nóng)藥的局限性迫切需要一種對環(huán)境友好且高效的線蟲生防制劑。捕食線蟲真菌(Nematode-trapping fungi)生活方式靈活且是殺線蟲生防制劑研究最多的,其原本能在土壤中營腐生生活,當處于低氮源環(huán)境且有活線蟲或線蟲提取物存在的條件下其營養(yǎng)菌絲會特化形成捕食器官(捕器),捕器的生成標志著生活史的改變,捕器可分為三維菌網(wǎng)、粘球、粘性分枝和的收縮環(huán)等類別。捕食線蟲真菌殺線蟲共分為4步:吸引、固定、侵入、消化。雖然當下用于殺線蟲的生防制劑已有報道,但由于線蟲的生活條件限制了捕食線蟲真菌的殺線蟲效果,且捕食線蟲真菌與線蟲的相互作用及相關(guān)機制也不是很清楚,所以繼續(xù)探究捕食線蟲真菌殺線蟲的機制還是相當?shù)挠薪ㄔO(shè)性意義的。本文基于RNA-Seq技術(shù)對在加入秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans)稀釋液0 h、24 h、72 h三個時間后產(chǎn)粘球的捕食線蟲真菌蟲生亞隔指孢(Dactylellina entomopaga)的進行轉(zhuǎn)錄組學分析,以挖掘更多的毒力因子及相關(guān)的毒力基因從而完善捕食線蟲真菌的浸染機制信息庫。分析方法:使用 Blast2GO 軟件進行 Non-Redundant Dataset(NR)和 Gene Ontology(GO)以及InterProScan的blast 比對;將clean reads比對到基因組上并計算出每個基因的reads數(shù)目(count值)使用edgeR軟件基于reads計數(shù)的方法篩選得到顯著差異基因(Significantly differentially expressed genes,SDEGs);對顯著差異基因進行多個蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫注釋和富集。本文發(fā)現(xiàn):未誘導(dǎo)狀態(tài)到誘導(dǎo)前期,顯著上調(diào)差異基因富集到的Pathway有核糖體與氮代謝;誘導(dǎo)前期到誘導(dǎo)后期顯著上調(diào)差異基因富集的Pathway是過氧化物酶體;未誘導(dǎo)狀態(tài)到誘導(dǎo)后期,顯著上調(diào)差異基因富集的Pathway為核糖體、產(chǎn)熱、MAPK信號通路、氧化磷酸化、酪氨酸代謝、黑素原生成、河馬信號通路等。依據(jù)多篇文獻報道還假設(shè):在連續(xù)上調(diào)的基因中,蛋白質(zhì)注釋結(jié)果顯示:可能編碼蛋白為c型凝集素家族的基因de0208146可能與粘附過程相關(guān),de0201759也許參與定位線蟲;從誘導(dǎo)前期到誘導(dǎo)后期上調(diào)三十多倍的de0200602可能參與了線蟲的識別;de0204621可能與捕器粘性產(chǎn)生有關(guān)。
【圖文】：

圖２－１：邋ＲＮＡ－Ｓｅｑ測序流程圖逡逑２．３轉(zhuǎn)錄組分析逡逑轉(zhuǎn)錄組學分析的流程如圖２－２所示，具體如下文所述。逡逑２．３．１測序結(jié)果質(zhì)厘彳￡制逡逑在進行一系列分析之前必須對測序結(jié)果初始下機數(shù)據(jù)（ｒａｗ邋ｄａｔａ）進行評估，逡逑評估項目有：檢查ｒｅａｄｓ每個位置的堿基測序質(zhì)量，每條序列的測序質(zhì)量、是否有逡逑接頭殘留情況、不識別的堿基含量等。本實驗使用ＦａｓｔＱＣ邋（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａ逡逑ｔｉｃｓ．ｂａｂｒａｈａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｆａｓｔｑｃ／）對測序數(shù)據(jù)進行質(zhì)量控制，接著使用Ｍｕ丨ｔｉＱＣ逡逑［２３］對結(jié)果進行整合。逡逑２．３．２基因組比對及ｒｅａｄｓ的定量逡逑由于在構(gòu)建ｃＤＮＡ文庫以進行測序之前，是在ｍＲＮＡ中加入特定的打斷試劑逡逑將其打斷成短序列，接著以打斷的ｍＲＮＡ作為模板反轉(zhuǎn)錄生成ｃＤＮＡ，再經(jīng)過一逡逑系列的操作后進行測序的，，因此使用ＨＩＳＡＴ２邋（ｃｃｂ．ｊｈｕ．ｅｄｕ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｈｉｓａｔ２／ｉｎｄｅｘ．ｓｈ逡逑ｔｍｌ）將ｒｅａｄｓ比對到參考基因組上以了解ｒｅａｄｓ在參考基因組上的位置。逡逑在上一步的基因組比對后得到了哪些ｒｅａｄｓ是屬于哪個基因的，接著使用逡逑ｆｅａｔｕｒｅＣｏｕｎｔｓ［２４Ｈ十算比對到所有基因的ｒｅａｄｓ數(shù)（ｃｏｕｎｔ）為使用ｅｄｇｅＲ軟件算出基逡逑因的表達豐度變化以找出差異表達基因。逡逑８逡逑

（錯誤率在０．１邋％以下）之間的，說明每條序列的測序質(zhì)量都挺好，結(jié)果通過；逡逑測序過程中ｒｅａｄｓ的某個位置的堿基無法確定為哪種堿基時則將其標記為Ｎ，在任逡逑意位置的Ｎ邋％邋＞邋５時該模塊就生成一個警告，從圖３－４可以看出所有的位置Ｎ邋％都逡逑遠遠小于５，說明測序結(jié)果有著很小的數(shù)據(jù)讀取偏差。綜合上述結(jié)果認為該下機逡逑數(shù)據(jù)可以用于后續(xù)的轉(zhuǎn)錄組學分析。逡逑ＦａｓｔＱＣ：邋Ｍｅａｎ邋Ｑｕａｌｉｔｙ邋Ｓｃｏｒｅｓ逡逑ｓｏ邐NB：邋：邐＇匕二＇．：：土．…廣Ｖ．逡逑４０逡逑ｇ邋３0逡逑Ｉ逡逑？逡逑２０邐４０邐６０邐８０逡逑Ｐｏｓｉｔｉｏｎ邋（ｂｐ）逡逑圖３－２：邋ｒｅａｄ的第１￣９０個堿基的測序質(zhì)量情況逡逑圖中共有六條綠線，分別代表測序的六條序列。橫坐標表示ｒｅａｄｓ的第１？９０逡逑個堿基，縱坐標表示堿基測序質(zhì)量打分（Ｑ邋＝邋－１０邋＊邋ｌｇＰ其中ｐ表示的是堿基測序錯逡逑誤率）的平均數(shù)，圖中共有三個背景色，依次是綠色（表示的是Ｑ＞邋３０堿基測序逡逑錯誤率在０．１邋％以下，而正確率在９９．９％以上），當打分在此區(qū)域時表示達到了逡逑很好的測序質(zhì)量；在黃色區(qū)域時表示是處于相對合理的范圍；當打分落在紅色區(qū)逡逑域時即為測序質(zhì)量較低的情況。逡逑１３逡逑
【學位授予單位】：云南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：Q93;Q78

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本文編號：2638876