【摘要】：白沙蒿(Artemisia sphaerocephala)為菊科蒿屬沙生灌木,對荒漠生態(tài)系統(tǒng)的維持和恢復具有重要意義,同時其富含亞油酸、維生素E等,具有一定保健功效。隨白沙蒿轉(zhuǎn)錄組測序的完成,對該物種基因功能的認知迫切。病毒誘導的基因沉默(Virus-induced gene silencing,VIGS)技術(shù)不需建立遺傳轉(zhuǎn)化體系,可快速驗證植物基因功能,在非模式植物中被廣泛應用。PDS(Phytoene desaturase,PDS)基因是合成類胡蘿卜素的關(guān)鍵基因,該基因被沉默導致葉綠素合成途徑被阻斷,植物呈易分辨的“光漂白”表型,是探索VIGS體系的首選基因。本研究以白沙蒿為材料,選用煙草脆裂病毒(Tobacco rattle virus,TRV)為載體,PDS為目標基因,構(gòu)建正反向重組載體。以注射法(Injection method,I)、真空滲透(Vacuum infiltration,V)、真空滲透+超聲波(Vacuum infiltration+ultrasonic,V+U)三種接種方法,OD_(600)=0.5、0.8、1.0、1.5四種菌液濃度,將含有重組載體的農(nóng)桿菌菌液對子葉期和真葉期幼苗分別各處理24組,探索VIGS體系在白沙蒿中的可行性。主要結(jié)果如下:(1)克隆得到441 bp白沙蒿PDS基因片段AsPDS-F和AsPDS-R,構(gòu)建出TRV病毒的正反向重組載體pTRV_2-AsPDS-F、pTRV_2-AsPDS-R。(2)子葉期VIGS體系建立受接種方法、菌液濃度和靶基因插入方向的極顯著影響。子葉期VIGS體系最佳處理組為V+U-1.5-R,白化程度達0.72,白化部位在第一、二對真葉處。(3)真葉期白沙蒿VIGS體系的建立,分別受接種方法和菌液濃度極顯著和顯著影響,靶基因插入方向?qū)w系的建立無影響。真葉期白沙蒿VIGS最佳處理組為I-1.5-R,其白化程度為0.34,白化部位在第三、四對真葉處。(4)子葉期白沙蒿VIGS體系中14組處理產(chǎn)生陽性植株,白化程度總均值為0.15;真葉期5組處理產(chǎn)生陽性植株,白化程度總均值為0.05。子葉期產(chǎn)生的陽性植株和白化程度均優(yōu)于真葉期。本研究在白沙蒿中建立了快速、高效的功能基因沉默體系,為后續(xù)該物種的基因功能研究提供了技術(shù)支撐。
【圖文】：

2008; Voinnet, 2001)。其中，已在高等植物中廣因沉默（Post-transcription gene silencing，PTGS），而錄后的基因沉默(Holzberget al., 2010; Ruiz and Baulc入，病毒誘導的基因沉默用于表征基因功能的一種基導基因沉默體系的作用機制一種 RNAi（RNA interference，RNA 干擾）下調(diào)基因的病毒侵染宿主，，向下調(diào)控內(nèi)源基因的表達水平并引究靶基因功能(Fuet al., 2002; Kammen, 1997)。最早，式植物本氏煙草的研究(Burch-Smith et al., 2006)，這理論基礎。病毒誘導的基因沉默包含 3 個關(guān)鍵步驟：段與合適的病毒載體進行重組；第二，將含有病毒載主植物；第三，利用植物抵抗病毒感染的防衛(wèi)機制沉VIGS 機理屬于 RNA 沉默范疇，包含兩條途徑。

圖 3-1 AsPDS-F、AsPDS-R 基因片段的獲得在大腸桿菌中的檢測化的 AsPDS-F、AsPDS-R 基因與線性載體連接后，轉(zhuǎn)陽性單克隆。體 pTRV2-AsPDS-F 在大腸桿菌中的檢測的 7 個陽性單克隆，進行菌液檢測。均獲得單一清晰條帶（圖 3-2），分別將其回收測序，得到序列信息結(jié)果，發(fā)現(xiàn)第 6 泳道目的片段與白沙蒿 PDS 序列一，無堿基突變（圖 3-3），重組載體 pTRV2-AsPDS-F
【學位授予單位】：蘭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：Q943.2

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本文編號：2632491