【摘要】：褪黑素(N-乙�；�-甲氧基色胺,melatonin,MT)在動物體內中具有抗氧化作用,植物體內可能有類似功能。作為一種多效信號分子,MT能增強植物對各種生物和非生物脅迫的耐受性,在植物生長、發(fā)育和環(huán)境脅迫中具有重要作用。研究資料顯示MT誘導植物抗氧化酶活性,增強植物的抗逆性能,在綠藻中同樣表現(xiàn)著良好的鹽脅迫防御特性,但是MT抗氧化保護作用的機制還有很多未知。“綠色酵母”萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)是一種單細胞綠藻,生長速度快,分子遺傳學背景簡單,常被當做模式微藻用于植物功能基因及次生代謝產物等研究。禾本科燕麥屬植物莜麥又稱裸燕麥(Avena nuda L.),是我國高寒山區(qū)特有的優(yōu)質雜糧之一,具有獨特的營養(yǎng)價值和保健功能,但是其生長受到非生物脅迫限制,制約其利用和發(fā)展。二者的研究中,有關MT功能資料還很匱乏,鹽脅迫條件下單細胞藻類和高等植物莜麥中的MT功能研究薄弱。本研究分別以萊茵衣藻和莜麥為實驗材料,探討MT在植物中的抗氧化功能。具體包含兩部分內容:一部分是借助微藻基因工程的反義RNA技術,玻璃珠法轉化萊茵衣藻CC-503,獲得MT合酶基因AANAT沉默的轉基因萊茵衣藻,進而探討鹽脅迫下萊茵衣藻生長及抗氧化變化;另一部分關注外源施加MT條件下,高等植物莜麥的鹽脅迫響應。通過本論文探討鹽脅迫中MT對植物生長的保護力,為植物中MT的功能研究提供參考,推動MT在藻類及植物中的功能研究。主要研究內容如下:(1)構建了含目的基因aanat的萊茵衣藻核反義表達載體pDBle-aanat:將已獲得的含有目的片段aanat的克隆載體pMD18-aanat雙酶切并純化回收目的片段,然后用T4-DNA連接酶將aanat基因片段反向連接到pDBle載體上,轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞。經PCR、雙酶切和測序進行鑒定目的菌株的鑒定,結果表明表達載體構建正確。(2)萊茵衣藻的遺傳轉化及篩選鑒定,獲得轉化藻株:萊茵衣藻的遺傳轉化及篩選鑒定,轉化藻株經過博來霉素(Ble)抗性篩選培養(yǎng)后,再提取轉化衣藻的DNA和RNA,分別進行ble基因PCR檢測及AANAT基因表達水平qRT-PCR的檢測等方法,最終獲得了陽性藻株ARn(n為不同轉基因藻系),并證明了aanat基因成功整合進了衣藻核基因組中并下調了AANAT基因的表達。(3)轉基因藻株的生長情況:分別測定野生型藻(WT)和ARn藻系的OD值,連續(xù)7 d數(shù)據(jù)統(tǒng)計顯示,ARn系的生長曲線趨勢與WT藻系基本相一致,沒有受到外源aanat基因整合的影響,只是轉基因藻細胞密度較低。但是測定的不同ARn藻系中MT的含量平均為10.37 pg/mL,低于野生藻(MT含量為11.86 pg/mL),證實萊茵衣藻核基因組中AANAT基因沉默降低了MT的合成。(4)aanat基因沉默微藻(內源MT)在鹽脅迫處理中的生理響應:(1)測定了不同藻株細胞內MT濃度,發(fā)現(xiàn)轉化藻株AR_3中MT濃度均顯著(p0.05)地低于未轉化藻株,說明AANAT基因沉默藻株AR_3在鹽脅迫后MT含量降低;(2)在50 mM和100 mM NaCl脅迫環(huán)境中,與WT衣藻相比,AR_3藻株中清除活性氧(ROS)和丙二醛(MDA)的能力較弱一些;抗氧化物酶活性和基因的表達情況均降低/下調。此結果說明了AR_3清除ROS和恢復細胞損傷的能力減弱。(5)外源MT對莜麥鹽脅迫下的防護作用:(1)在150 mM NaCl鹽脅迫下,外施不同濃度MT處理后,莜麥的株高、莖粗、鮮重、干重、葉綠素含量、葉面積和葉體積均增加;而葉綠素合成酶基因(ChlG)的表達量平均提高了6.40倍。這些結果說明MT有利于植物生長;(2)在150 mM NaCl鹽脅迫下,外施不同濃度MT處理后,莜麥幼苗葉片過氧化氫(H_2O_2)、超氧陰離子(O_2~(·-))和MDA含量減少;超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)和抗壞血酸過氧化物酶(APX)的活性均提高。該結果顯示出MT可以提高植物抗氧化能力,可能是通過清除細胞ROS和增加抗氧化物酶的活性來實現(xiàn)這一功能;(3)150 mM NaCl鹽脅迫下,外施不同濃度MT處理后,滲透調節(jié)物質脯氨酸的含量均增加;而細胞內可溶性蛋白含量則降低;細胞內脂質過氧化物酶基因(LOX和POX)表達量均上調。這些結果證實了在莜麥中脯氨酸可能是主要的滲透調節(jié)物質,同時也證實了MT可以誘導細胞抗鹽性相關基因的表達,進而提高植物對鹽脅迫的耐受性;(4)在150 mM NaCl鹽脅迫下,外施不同濃度MT處理后促分裂原活化白激酶(MAPK)級聯(lián)途徑中的MAPK蛋白激酶(Asmap1和Aspk11)基因表達量均上調以及轉錄因子(TFs)NAC、WRKY1、WRKY3和MYB的表達量也均上調。這些結果揭示了MT在鹽脅迫緩解中的重要作用,推測MT可能有類似與油菜素內酯(BRs)的作用,即通過介導MAPK介導H_2O_2信號通路,促進抗鹽脅迫相關基因表達,進而提高莜麥對鹽脅迫的耐受性。不管是MT合酶基因AANAT的低表達實驗,還是外施MT實驗均證實了MT的確具有抗氧化的功能。
【圖文】：

圖 1 MT 在植物和動物中的生物合成途徑[43]e 1 Biosynthetic pathway of MT in plants and in animals[4長發(fā)育的調控作用早被關注的是其可以作為生長調節(jié)劑對植物的生長在黃化的羽扇豆中已經得到證實[44]。與生長素（I可促進下胚軸的生長，較高濃度則具有抑制作用。內濃度梯度分布，推測與下胚軸的不同生長潛力有關。物中也有被證實[8]。外源性 MT 促進不同植物組織生的行為[45]，在紅甘藍[46]和芥菜[47]中 MT 具有促進/抑 MT 之間的關系還未得到證實，但它似乎可以并行A 的促進根莖生成的功能，MT 能夠從羽扇豆中的周根或側根[48]。這種根莖效應已在其他物種中也有研。另外在體外應用中，MT 作為細胞保護劑（抗氧化

胞對應激的反應主要由細胞外物質與質膜蛋白的相互作用引發(fā)，這意味著植上存在應激的受體。細胞膜受體將應激信號轉導到下游，引發(fā)產生包括 C 的第二信使，已經鑒定出許多轉錄因子（TFs），可以被 MT 上調[64]，MT 錄物中也有與氧化還原穩(wěn)態(tài)相關的基因，這些基因與生物和/或非生物脅迫。MT 也調節(jié)與特定應激相關基因的表達。例如，，MT 通過下調葉綠素酶（CLH表達[63]維持葉綠素含量，MT 也可通過下調了 PAO 基因的表達減緩蘋果葉55]。高鹽脅迫過程由于滲透勢的變化會產生離子毒性[11]。NHX1 和 AKT1 是基因有助于維持離子穩(wěn)態(tài)。植物葉片中 NHX1 和 AKT1 基因表達的上調，有植物的耐鹽性[74]。此外，MT 可上調 C 重復結合因子（CBFs）/干旱反應元子（DREBs）的表達，進而激活 CAMTA1 和 ROS 相關的抗氧化基因 ZAT12 的轉錄激活，減少冷脅迫對植物的傷害[99]。MT 在調節(jié)多種基因的表達中作用，反映其在植物中的多效生理作用[63]。據(jù)記載，MT 還可通過直接猝滅響有毒金屬的螯合作用進而提高植物對金屬離子脅迫的耐受性[75]。
【學位授予單位】：西北大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：Q945

【參考文獻】

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本文編號：2619901