【摘要】：宏基因組和單細(xì)胞測(cè)序方法不僅可以檢測(cè)到環(huán)境中未培養(yǎng)微生物所含有的未知基因,而且可以發(fā)現(xiàn)這些未培養(yǎng)微生物潛在的重要代謝功能和生態(tài)位;但是,這些以基因或基因組為基礎(chǔ)的技術(shù)不能對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行全面仔細(xì)的研究,獲得菌株的純培養(yǎng)仍然是非常必要的;為了解決這個(gè)問(wèn)題,目前己開發(fā)出多種未培養(yǎng)細(xì)菌的培養(yǎng)方法,但對(duì)細(xì)菌的純培養(yǎng)中仍有許多困難亟待解決,如分離效率的下降,優(yōu)勢(shì)菌群對(duì)其他物種的影響,細(xì)菌細(xì)胞間信息的交流對(duì)生長(zhǎng)的影響分離過(guò)程中所涉及的高端儀器的使用問(wèn)題等。本文以實(shí)驗(yàn)室常用的培養(yǎng)基和可培養(yǎng)細(xì)菌為基礎(chǔ),結(jié)合自然界中細(xì)菌個(gè)體之間會(huì)產(chǎn)生相互作用的現(xiàn)象,設(shè)計(jì)了夾心平板技術(shù),并且通過(guò)對(duì)海洋細(xì)菌的多樣性研究對(duì)本方法進(jìn)行了初步的驗(yàn)證。夾心平板技術(shù)中,夾心培養(yǎng)基共分為上、中、下三層;下層為實(shí)驗(yàn)室常用的2216E培養(yǎng)基,上層為改良的1/10 2216E培養(yǎng)基,中間用可培養(yǎng)細(xì)菌作為夾心菌株;通過(guò)對(duì)夾心菌株的涂布面積,夾心菌株的處理方式,上層培養(yǎng)基瓊脂的濃度等方面的優(yōu)化,最終確定夾心菌株在下層培養(yǎng)基表面涂布區(qū)域的直徑約為70mm,上層培養(yǎng)基的瓊脂濃度為4%(w/v),并且直接將上層培養(yǎng)基傾倒在夾心菌株表面。采用夾心平板法對(duì)威海近海沉積物中的細(xì)菌多樣性進(jìn)行研究,結(jié)果表明:實(shí)驗(yàn)組S25、S63、S69和S70在其夾心菌株的作用下可以使表面細(xì)菌的多樣性增加,而S08、S09、S12、S38和S39組在其夾心菌株的作用下可以使表面細(xì)菌的多樣性降低;在屬水平,各實(shí)驗(yàn)組中優(yōu)勢(shì)菌群豐度變化較為明顯的是Psychrobacter、Ruegeria、、Microbulbifer、Aequorivita和Bacillus五個(gè)屬;在潛在新物種方面,各組在夾心菌株的作用下均可以增加新菌的比例,尤以S08、S25、S38、S39、S69 和 S70 組最為明顯,并且Flavbbacteriaceaae、Moraxellaceae、Rhldobacteraceae、Halomonadaceae和Phyllobacteriacea 等科的潛在新物種在各組之見差異性較為明顯;通過(guò)純培養(yǎng),共得到481株菌,分布于Actinoba和Pria、Bacteroidetes、Firmicutes和Prottobacter 4 4個(gè)門中,其中共有149株潛在新物種,新種124株,新屬新種24株,新科新種1株;并且,通過(guò)對(duì)分離菌株的篩選和驗(yàn)證,得到17株具有生長(zhǎng)依賴現(xiàn)象的菌株。此外,本文對(duì)三株新菌進(jìn)行了多相分類。菌株M1309~T分離于威海海參養(yǎng)殖池沉積物,為革蘭氏陰性菌,桿狀且具有滑動(dòng)性;生長(zhǎng)溫度范圍16-42℃,最適生長(zhǎng)溫度為37℃;生長(zhǎng)pH范圍為6.5-8.0,最適pH為7.0-7.5;生長(zhǎng)鹽度范圍為 2.0-6.5%(w/v)NaCl,最適鹽度為 2.0-3.0%(w/v)NaCl;根據(jù) 16S rRNA基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,發(fā)現(xiàn)菌株M1309bT屬于Winogradskgella屬,與其最相似的物種為Winogradskyella porferorum JCM 12885~T,相似度為95.5%;通過(guò)對(duì)菌株M1309~T的化學(xué)特征分析,發(fā)現(xiàn)其呼吸醌型只有一種為MK-6,主要脂肪酸種類為iso-C_(15:0)、iso-C_(15:1) G和iso-C_(17:0) 3-OH,主要極性脂為PE、兩種AL和三種未知的脂肪酸L;基因組DNA含量為36.1mol%;根據(jù)表型的特異性和系統(tǒng)發(fā)育的差異性,認(rèn)為菌株M1309~T為Wnogradskye為 屬的新物種,并將其命名為Winogradskyella tangerina;模式菌株為 M1309~T(=KCTC 52896~T= MCCC 1K03310~T)。菌株ELS1360-T分離自內(nèi)蒙古湖泊沉積物,為革蘭氏陰性菌、兼性好氧、運(yùn)動(dòng)形式為滑動(dòng)、菌體為桿狀、菌落為粉紅色;在不含NaCl的R2A培養(yǎng)基上,溫度為33℃,pH為6.5-7.0時(shí)生長(zhǎng)最佳;根據(jù)16S rRNA基因序列,菌株ELS1360~T與菌株Hymenobacter luteus JCM 30328~T和Hymenobacterlatericoloratus JCM 30327~T最為相似,相似度分別為96.9%和96.8%,與Hymenobacter屬的其他成員的相似度均在90.3-96.7%之間;通過(guò)發(fā)育樹分析菌株ELS1360~T屬于Hymenobacter屬,并且與菌株Hymenobacterluteus JCM 30328~T和Hymenobacte lericoloratul JCM 30327~T聚在一枝;呼吸醌型為MK-7;主要脂肪酸為iso-C_(15:0),Summed feature 3和C_(16:1)ω5c;主要極性脂為PE、APL和未知的脂肪酸L;基因組DNA的G+C為57.1mol%;通過(guò)系統(tǒng)發(fā)育、表型、基因型和化學(xué)分類學(xué)分析,認(rèn)為菌株ELS1360~T是Hymenobacte是屬的一個(gè)新物種,并命名為Hymenobacter sediminis;模式菌株為ELS1360~T(=KCTC62449~T=MCCC 1H00319~T)。菌株N24~T分離自西安溫泉水,為革蘭氏陰性菌、具有滑動(dòng)性、桿狀(寬約0.4-0.8μm,長(zhǎng)約1.8-7.8μm);最適生長(zhǎng)溫度為33℃,最適生長(zhǎng)pH為7.0;可以產(chǎn)生胞外多糖;通過(guò)系統(tǒng)發(fā)育樹分析,發(fā)現(xiàn)菌株N24~T在Chitinophagaceae科中形成單獨(dú)的一枝,最相似的屬為Flavisobacter、Cnuella、Niveitalea、Flavitalea、Flaviaiaturariibacter和Niatella,16S rRNA基因的相似度為91.7-93.9%;主要脂肪酸種類為iso-C_(15:0)(31.8%)、iso-C_(17:0) 3-OH(16.1%)和iso-C15：1 G(12.9%);極性脂成分為PE、兩種AL和六種未知的脂肪酸L;呼吸醌型為MK-7;基因組DNA的G+C含量為49.3mol%;通過(guò)系統(tǒng)發(fā)育、表型、基因型和化學(xué)分類學(xué)分析,認(rèn)為菌株N24~T是Chitinophagaceae科的一個(gè)新屬新種,并命名為Paracnuella aquatica;模式菌株為N24~T(=KCTC62083~T=MCCC 1H00301~T)。
【圖文】：

養(yǎng)皿底部鋪一層１．５％瓊脂的固體培養(yǎng)基，之后，傾倒含有潛在助長(zhǎng)菌（生長(zhǎng)狀逡逑況較好）的０．４％瓊脂軟培養(yǎng)基，鋪上帶有濾膜的聚丙烯環(huán)后，在濾膜上傾倒含逡逑有潛在依賴型菌株（生長(zhǎng)狀況較差）的軟瓊脂培養(yǎng)基（如圖１－１所示），培養(yǎng)后逡逑觀察表面菌落的生長(zhǎng)狀況［６４］；利用此技術(shù)篩選到了邐ｓｐ．邋ＢＬ１５７和逡逑Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ邋ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ邋ＢＬ１７５，Ｂａｃｔｅｗｉｄｅｓ邋ｆｒａｇｉｌｉｓ邋ＢＬ５３９邋和邋Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ邋ｓｐ．邋ＢＬ２５２逡逑等多組具有助長(zhǎng)作用的細(xì)菌。逡逑＿邋．一逡逑圖１邋一１單菌落共培養(yǎng)裝置示意圖逡逑Ｆｉｇ邋１—１邋Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ邋ｄｉａｇｒａｍ邋ｏｆ邋ｓｉｎｇｌｅ邋ｃｏｌｏｎｙ邋ｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅ邋ｄｅｖｉｃｅ逡逑共培養(yǎng)技術(shù)的出現(xiàn)，在一定程度上說(shuō)明，，易培養(yǎng)的細(xì)菌菌株對(duì)難培養(yǎng)或生長(zhǎng)逡逑依賴型細(xì)菌的培養(yǎng)具有一定的促進(jìn)作用；但，目前開發(fā)出的共培養(yǎng)技術(shù)及篩選生逡逑長(zhǎng)依賴型菌株的方法的應(yīng)用的前提基本是先獲得難培養(yǎng)菌株的純培養(yǎng)物，之后再逡逑用易培養(yǎng)菌株刺激其生長(zhǎng)，并不能直接用于從環(huán)境樣品中分離未培養(yǎng)、難培養(yǎng)或逡逑生長(zhǎng)依賴型菌株；此外，共培養(yǎng)技術(shù)仍不太成熟，需要進(jìn)一步的開發(fā)。逡逑１．３立題依據(jù)逡逑任何一種細(xì)菌都必須先在體外培養(yǎng)，然后才能全面研究其生理生化特征，才逡逑５逡逑

圖２－１夾心平板表層污染示意圖逡逑ａｔｉｃ邋ｄｉａｇｒａｍ邋ｏｆ邋ｓａｎｄｗｉｃｈ邋ｐｌａｔｅ邋ｓｕｒｆａｃｅ邋ｃｏ下層培養(yǎng)基表面的涂布面積逡逑養(yǎng)基表面的涂布區(qū)域直徑設(shè)置約為４０、，上層１／１０邋２２１６Ｅ培養(yǎng)基冷卻到５０°Ｃ左覆蓋一層玻璃紙或?yàn)V紙逡逑后，在表面覆蓋一層玻璃紙或者濾紙片積大，操作時(shí)盡量使兩者與培養(yǎng)基表面層培養(yǎng)基從濾紙片或玻璃紙的中心開始察，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置１０個(gè)平行，重復(fù)３培養(yǎng)基混合后再傾倒上層培養(yǎng)基逡逑
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：Q93

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本文編號(hào)：2618922