【摘要】：近年來,超分辨熒光顯微鏡不僅可以對原位細胞膜上的蛋白進行特異性標記,而且還可以達到單分子精度,實現(xiàn)納米級的成像,這對于研究細胞膜上的蛋白分布特點具有重要作用。然而,細胞膜上的蛋白分布緊密,這對蛋白標記又提出了新的挑戰(zhàn),最近提出的延展顯微鏡將生物樣品機械性放大進而突破了光學衍射,這就使得原本排列緊密的生物分子距離增加。本論文將延展顯微鏡(Expansion microscopy,ExM)與隨機光學重構(gòu)顯微鏡(Stochastic optical reconstruction microscopy,STORM)兩種技術(shù)相結(jié)合,通過對擴展后的細胞膜上蛋白進行STORM成像,研究細胞膜上蛋白質(zhì)的分布特點。采用延展顯微鏡操作方法將A549-GFP細胞黏附于凝膠上,利用轉(zhuǎn)盤激光掃描共聚焦顯微鏡對凝膠擴展前后的細胞進行成像對比。結(jié)果顯示,A549-GFP細胞隨著凝膠的擴展,細胞也隨之增大。細胞的增大倍數(shù)與擴展溶液中離子含量以及擴展時間都有關(guān)系,在去離子水中,細胞可獲得最大倍數(shù)的擴展,各方向可達2.51±0.47倍。為了對細胞膜上蛋白質(zhì)進行觀察分析其分布特點,本論文分析對比了多種不同思路來制備擴展后的細胞膜,最終發(fā)現(xiàn)將細胞膜與凝膠共價靶向相連后,可以在擴展后的凝膠上撕取擴展后的細胞膜。利用上述制備的擴展后細胞膜經(jīng)抗體特異性標記后,使用dSTORM進行成像發(fā)現(xiàn),擴展后的細胞膜上Band III蛋白定位點密度從475.4±27.73μm~(-2)減小到386.9±40.86μm~(-2),簇密度從1.373±0.0898μm~(-2)減少到1.126±0.1066μm~(-2),擴展前較大的蛋白簇變小,細胞上蛋白簇的平均面積從11866±649.8 nm~2減少到5749±546.4 nm~2,簇內(nèi)定位點數(shù)也減少,簇內(nèi)平均點數(shù)140.1±9.927變?yōu)?16.1±6.737。單個蛋白間距離也增加從47.61±2.62 nm變?yōu)?7.81±5.21 nm。利用dSTORM對RNA aptamer標記的細胞膜外側(cè)EpCAM蛋白進行成像也發(fā)現(xiàn)相同的結(jié)果,隨著凝膠的擴展,細胞膜上蛋白簇的直徑變小,簇內(nèi)點數(shù)變少。而單個蛋白間距離增加,擴展前39.53±3.53 nm增加到擴展后92.11±6.75 nm,擴大了2.3倍。比抗體而言,RNA aptamer體積小,標記效率更高,熒光探針擴展后距離也增加更大,更有利于成像。這一研究成果證實延展顯微鏡和單分子定位顯微鏡兩種超分辨顯微鏡的聯(lián)合使用,對于研究細胞膜上蛋白的分布特點,闡明蛋白簇的形態(tài)結(jié)構(gòu)具有重要意義。
【圖文】：

圖 1-1 延展顯微鏡的原理[13]Fig.1-1 Concept of expansion microscopy (ExM)[13]記的三功能團標記物結(jié)構(gòu)示意圖；b）ExM 標記圖解，其中綠色代表細胞微凝膠網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)；c) 三功能團標記物連接凝膠和生物樣品的分子圖解，紫色，灰色代表抗體，藍色代表寡核苷酸片段，橙色圓點代表三功能團標記物烯�；�，綠色圓圈代表熒光分子；d) ExM 凝膠網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)圖，黑色圓點表示子水擴展后的凝膠網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)圖。atic of label that can be anchored to the gel at site of a biomolecule; b) Schematicules (green) and polymer network (orange); c) The label of b), hybridized to thearing secondary antibody top (top gray shape) bound via the primary (bottom grayules (purple), is incorporated into the gel (orange lines) via the methacryloyl grouchematic of collapsed polyelectrolyte network, showing cross linker (dot) and poe); e) Expanded network after H2O dialysis.展后的生物樣品通過熒光顯微鏡進行成像，目前使用較多的是寬掃描轉(zhuǎn)盤激光掃描共聚焦顯微鏡，凝膠經(jīng)過 4.5 倍的線性擴展，E到 60~70 nm[25]。

圖 1-2 iExM 原理圖解[28]Fig.1-2 iterative ExM (iExM) concept[28]M 原理圖解，a）生物樣品；b）第一次凝膠；c）擴展；d）第二次凝膠再次擴展；f) - j）iExM 原理分子圖解，，f）一抗（灰色）、偶聯(lián)寡核苷（灰色）以及含有寡核苷酸鏈 A（綠色，與 A'互補）和甲基丙烯�；� I 標記生物分子（灰色圓圈）；g）第一次凝膠示意圖（1 和 2 代表兩個在雙重去離子水中擴展后，帶有熒光團（黃色）、寡核苷酸鏈 A'（紫色黑色圓點）的三功能團標簽 II 與功能團標簽 I 雜交示意圖；i）第二次凝次合成的凝膠，再次進行擴展后生物分子（1 和 2）遠離的示意圖。ematic of iterative expansion.a) specimen; b) the first polyelectrolyte ged expansion.d) a second polyelectrolyte gel network, e) it is expanded after  j) Molecular view of the iExM process. f)Biomolecules of interest (gra with a primary antibody followed by a secondary antibody conjugated to a') molecule, then a complementary DNA (green,sequence A) bearing a ydite, black dot). g) The sample (two example biomolecules are labeled "n a cleavable swellable polyelectrolyte gel (blue mesh). This gel incorporate at the gel-anchoring site, and it is expanded. h) A DNA oligo with thpurple strand) bearing a fluorophore (yellow star) and a new gelanchlack dot) is hybridized to the anchored A sequence DNA (green). i) A sec
【學位授予單位】：哈爾濱工業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：Q241

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本文編號：2617855