【摘要】：脂類物質在維持有機體正常生命活動中承擔著重要的生物學功能。其中三酰甘油(Triacylglycerol,TAG)是植物油脂的主要儲存形式,TAG參與種子萌發(fā)和幼苗發(fā)育、花粉粒發(fā)育、葉片衰老和環(huán)境脅迫反應等。此外,TAG不僅是人類日常攝取卡路里的重要來源,而且還可用于人造黃油及新型清潔燃料(生物柴油)的生產。因此提高油料植物TAG含量成為提高作物品質和解決能源供給問題的重要目標。甘油二酰�；D移酶(DGAT)是TAG生物合成過程中的一個關鍵限速酶。在真核生物中,根據(jù)結構和活性的不同已經(jīng)鑒定出四種DGAT,其中DGAT1和DGAT2最為常見,對其研究也最多。因此表達不同來源的DGAT1或DGAT2成為提高植物TAG含量的重要策略。然而,已有報道指出,表達一些DGAT2并不能提高植物的TAG含量。同樣,在課題組前期研究中,將來自解脂耶氏酵母的DGAT2(YlDGAT2)轉入棉花并未提高棉花TAG含量,卻改變了轉基因棉花中TAG和游離脂肪酸的組成,提高了轉基因棉花的生物量和產量,但其機理尚不清楚。前人研究表明,不同來源的DGAT2其底物選擇偏好性也多不相同。有報道指出,YlDGAT2對飽和脂肪酰輔酶A具有選擇偏好性,而來自擬南芥的AtDGAT2對不飽和脂肪酰輔酶A具有選擇偏好性。為了進一步探究YlDGAT2在植物生長過程中的功能,本研究用組成型啟動子S7分別控制YlDGAT2和AtDGAT2在擬南芥中表達來評估不同底物偏好性的DGAT2對擬南芥生長的影響。主要結果如下:1.表達YlDGAT2提高了毛白楊、煙草和擬南芥的生物量,而超表達AtDGAT2對擬南芥的生物量沒有影響為了驗證YlDGAT2對植物生物量的影響,分別在毛白楊、煙草和擬南芥中表達YlDGAT2。結果顯示,相較于野生型,轉基因毛白楊株系2和株系5的株高分別增加了19%和11%;轉基因煙草株系S7-YD-2和S7-YD-10的地上部分生物量分別增加了59%和51%;轉基因擬南芥S7-YD-10和S7-YD-15株系的葉面積分別增加了38%和34%,且地上部分生物量分別提高了51%和49%。以上結果表明,表達YlDGAT2可以提高植物生物量,也能在其他植物中重演。然而,超表達AtDGAT2對擬南芥的生物量并沒有產生明顯影響。2.在釀酒酵母中,YlDGAT2對飽和脂肪酸有偏好性,而AtDGAT2對非飽和脂肪酸有偏好性在釀酒酵母中分別表達YlDGAT2和AtDGAT2,結果顯示,YlDGAT2和AtDGAT2轉基因酵母的TAG含量比對照分別增加了81%和40%。同時還發(fā)現(xiàn),YlDGAT2和AtDGAT2轉基因酵母的TAG組分發(fā)生了相反的變化。即AtDGAT2轉基因酵母TAG中不飽和脂肪酸相對含量上升,飽和脂肪酸相對含量下降;而YlDGAT2轉基因酵母TAG中飽和脂肪酸相對含量上升,不飽和脂肪酸相對含量降低。以上結果印證了YlDGAT2對飽和脂肪酸具有選擇偏好性,而AtDGAT2對不飽和脂肪酸具有選擇偏好性。3.超表達AtDGAT2顯著提高了擬南芥的TAG含量,而表達YlDGAT2未能提高擬南芥的TAG含量,且二者的TAG和游離脂肪酸組分產生了相反的變化表達YlDGAT2提高了轉基因植物的生物量,而超表達AtDGAT2則對擬南芥的生物量影響不大。為了探究造成這種差異的原因,檢測了各轉化子葉片和種子的TAG含量。結果顯示,與野生型相比,S7-AtDGAT2轉基因擬南芥S7-AD-17和S7-AD-19轉化子葉片中TAG含量分別提高了27%和31%,種子中TAG含量分別提高了26%和32%。而表達YlDGAT2未能提高擬南芥葉片和種子的TAG含量,這和前期S7-YlDGAT2轉基因棉花的觀察結果一致。此外,S7-YlDGAT2轉基因擬南芥葉片TAG中的飽和脂肪酸比例升高,不飽和脂肪酸比例下降;而在游離脂肪酸中,飽和脂肪酸的比例降低,不飽和脂肪酸的比例升高。與此相反,S7-AtDGAT2轉基因擬南芥葉片TAG中的飽和脂肪酸比例降低,不飽和脂肪酸比例升高;而在游離脂肪酸中,飽和脂肪酸比例升高,不飽和脂肪酸比例降低。以上結果說明,YlDGAT2和AtDGAT2的底物偏好性差異導致S7-YlDGAT2和S7-AtDGAT2轉基因擬南芥葉片TAG中的脂肪酸和游離脂肪酸的組成比例發(fā)生了相反的變化。4.表達YlDGAT2促進了擬南芥茉莉酸(JA)的生物合成,而超表達AtDGAT2擬南芥的JA含量未發(fā)生明顯變化與前期在轉基因棉花中結果一致,表達YlDGAT2提高了擬南芥亞麻酸含量,上調了JA生物合成相關基因的轉錄水平,進而提高了JA的含量。然而,S7-AtDGAT2轉基因擬南芥的JA含量未發(fā)生明顯變化。5.表達YlDGAT2促進了棉花和擬南芥?zhèn)雀陌l(fā)育相較于野生型,S7-YlDGAT2轉基因擬南芥S7-YD-10和S7-YD-15以及轉基因棉花S7-YD-3和S7-YD-4株系的幼苗側根數(shù)目均顯著增加,而主根長度明顯變短。JA響應因子ERF109能夠交聯(lián)JA信號和IAA的生物合成。隨著擬南芥中JA含量的提高,ERF109及下游IAA合成相關基因ASA1轉錄水平上調,擬南芥S7-YD-10和S7-YD-15的12 d幼苗根部IAA含量分別提高了37%和32%,表明,JA的適度增加促進了IAA在根部的生物合成,進而促進了轉基因棉花和擬南芥的側根的發(fā)育。然而S7-AtDGAT2轉基因擬南芥根系并未發(fā)生明顯變化,從側面印證了超量表達AtDGAT2并未促進JA的生物合成。6.表達YlDGAT2促進了T6P和淀粉的合成檢測結果顯示,S7-YlDGAT2轉基因擬南芥葉片中的T6P含量上升,淀粉含量增加,而蔗糖含量下降。相反,S7-AtDGAT2轉基因擬南芥葉片中的T6P含量變化不大,但其淀粉的含量和可溶性總糖、蔗糖顯著下降。說明表達YlDGAT2促進光合產物流向淀粉合成,減少了向TAG合成的分配,導致油脂含量有所降低。而超量表達AtDGAT2促進了碳源流向TAG合成,同時減少了向淀粉合成的分配。綜上所述,本研究為揭示DGAT的底物選擇偏好性和JA生物合成之間的聯(lián)系提供了證據(jù),也為提高作物的生物量和產量提供了有效策略。
【圖文】：

類的合成重疊，因為PA和DAG也是所有細胞中主要膜脂的前體。在三種�；D移酶中（GPAT、AGPAT和DGAT），只有DGAT專一合成TAG，由于DGAT在植物組織TAG合成途徑中的重要影響使其受到了最廣泛的關注（圖1.1）（Chapman KD & Ohlrogge JB,2012）。此外許多證據(jù)表明，植物中TAG的合成并不只是通過GPAT、LPAT和DGAT（中間含有一個PAP）連續(xù)酰化甘油的傳統(tǒng)的Kennedy途徑那樣簡單。近年來，在植物和酵母中發(fā)現(xiàn)了一種不依賴�；o酶A的�；D移酶：磷脂二酰基甘油�；D移酶（PDAT）（Dahlqvist Aet al., 2000）。PDAT以磷脂酰膽堿（PC）為�；w，催化DAG合成TAG（St hl et al., 2004; Henry et al., 2012; 譚太龍等，2014）。圖1.1 植物中�；蕾嚭头酋；蕾嘥AG合成途徑（Chapman KD & Ohlrogge JB, 2012）GPAT：甘油-3-磷酸酰基轉移酶；LPAT：溶血磷脂酸酰基轉移酶；PAP：磷脂酸磷酸酶；DGAT：甘油二酰酰基轉移酶；PDAT：磷脂二�；视王；D移酶Figure 1.1 Acyl-CoA-dependent and acyl-CoA-independent pathways for TAG biosynthesis in plants(Chapman KD & Ohlrogge JB, 2012)GPAT: glycerol-phosphate acyltransferase; LPAT: lysophosphatidic acid acyltransferase; PAP: phosphatidic acidphosphohydrolase; DGAT: diacylglycerol acyltransferase; PDAT: phospholipid: diacylglycerol acyltransferase.1.2 二�；视王；D移酶（DGAT）的研究進展1.2.1 DGAT 的種類和功能DGAT（EC 2.3.1.20）是 TAG 從頭合成途徑中的關鍵酶。不同類別的 DGAT 對裝載到 TAG 中的酰基輔酶 A 的種類和數(shù)量有著不同的選擇。在真核生物中

第 1 章 文獻綜述不同已經(jīng)鑒定出四種 DGAT（Sanjaya et al., 2013）。最常見的兩種類型是 DGGAT2，二者都被證明參與了 TAG 的合成（圖 1.2）（Yen et al., 2008）。DGAT1小鼠（Mus musculus）中被發(fā)現(xiàn)，而植物中首先在擬南芥中被鑒定（Cases et al., 19bs et al., 1999; Routaboul, et al., 1999）。據(jù)預測，DGAT1 蛋白具有六個或更多跨域，屬于膜結合氧-�；D移酶家族（Cases et al., 1998）。DGAT2 最先在產脂真被孢霉（Morteriella ramanniana）中被發(fā)現(xiàn)。在結構上，DGAT2 蛋白與 DGAT1僅具有二到三個預測的跨膜結構域（Yen et al., 2008）。第三類 DGAT 來自包含酶 ADP1 的不動桿菌（Acinetobacter calcoaceticus），表現(xiàn)出蠟酯合酶（WS）和 DG（Kalscheuer & Steinbüchel, 2003）。ADP1 同系物已在擬南芥和矮牽牛屬（矮牽交種）中被鑒定出，并表現(xiàn)出不同水平的 WS 和 DGAT 活性（King et al., 2007; L008）。第四類是一種可溶性細胞溶質 DGAT 酶（DAGT3），最先在花生中被鑒芥中存在同源基因（Saha et al., 2006; Hernández et al., 2012）。不同 DGAT 酶的好性可能決定了微藻和植物中 TAG 的脂肪酸組成（Sanjaya et al., 2013）。
【學位授予單位】：西南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：Q943.2

【參考文獻】

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1 苑麗霞;毛雪;高昌勇;張莉;薛金愛;楊致榮;李潤植;;種子特異表達二酰甘油�；D移酶基因(VgDGAT1)提高亞麻薺種子油脂積累[J];植物生理學報;2015年05期

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本文編號：2616357