【摘要】：磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine;PS)作為大腦中的主要酸性磷脂,具有提高認知力、抗壓抑等功效,可用于醫(yī)藥、食品等領域。由于自然界中含量較少,且提取困難,近年來,人們開始關注酶轉化法制備PS。即通過磷脂酶D(phospholipase D;EC 3.1.4.4;PLD)催化底物磷脂酰膽堿和L-絲氨酸合成。目前雖然取得了一定研究成果,但仍存在一些不足之處:(1)野生菌PLD分泌量遠低于工業(yè)生產(chǎn)標準;(2)現(xiàn)有研究中PS多采用有機相和水相兩相催化體系生成。基于此,本研究以Bacillus subtilis WB600為宿主,研究了PLD的異源高效表達,并優(yōu)化了PS在純水相中的生成條件。主要研究結果如下:(1)PLD的異源表達及信號肽優(yōu)化。將Streptomyces racemochromogenes來源的PLD基因按照枯草芽孢桿菌密碼子優(yōu)化性合成,并根據(jù)N端帶電荷數(shù)和H端疏水性選擇了7條來源于枯草芽孢桿菌的信號肽,將其融在PLD基因N端,將這7段融合片段克隆到表達質(zhì)粒pSTOP并轉入B.subtilis WB600中表達,比較了不同信號肽牽引下的PLD分泌效率。結果顯示,PLD在B.subtilis WB600中成功實現(xiàn)胞外異源分泌表達,且在信號肽amyE介導下獲得最高胞外酶活11.3 U×mL~(-1),是內(nèi)源性信號肽介導下胞外酶活分泌量的5.27倍,ywbN信號肽介導的胞外PLD酶活最低(3.2 U×mL~(-1))。(2)表達載體優(yōu)化。分別構建了3個重組表達質(zhì)粒pSTOP-PLD-amyE-his、pMA0911-PLD-amyE-his和pP43-PLD-amyE-his,包含這3個質(zhì)粒的重組菌分別命名為STT1、ST2和ST3。結果顯示,ST2和ST3的PLD酶活高于STT1,ST2菌株獲得最高酶活19.1 U×mL~(-1),比對照提高約69.03%,通過對3株菌的胞外上清液進行Western Blot檢測,在約53 kDa處均可見明顯單一條帶,與報道條帶大小相符。(3)RBS及spacer區(qū)優(yōu)化。通過RBS Calculator v2.0軟件對重組質(zhì)粒pMA0911-PLD-amyE-his的RBS及spacer區(qū)進行優(yōu)化,選擇了翻譯效率較原始序列分別提高3、6、9、12倍的四種組合,分別得到RS1、RS2、RS3和RS4這4株重組菌。結果顯示RS1菌株獲得最高胞外酶活24.2 U×mL~(-1),較對照提高約26.7%,而RS4菌株胞外酶活反而較對照降低約11.8%。我們發(fā)現(xiàn)隨著RBS強度的增加,PLD胞外分泌量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢,這表明RBS的翻譯強度并不明顯與PLD的分泌量呈正相關。(4)15 L發(fā)酵罐實驗及酶學性質(zhì)研究。15 L發(fā)酵罐實驗,酶活提高約5倍,達到116.2U×mL~(-1)。對RS1菌株進行遺傳穩(wěn)定性實驗,重組質(zhì)粒經(jīng)過5代后的保留率仍為100%。純化RS1菌株的胞外上清液,測定PLD酶學性質(zhì)。結果表明,PLD蛋白條帶大小約為53 kDa,與已報道條帶大小相符,最適反應溫度45℃,最適反應pH 5.5,4℃下可長期保藏。(5)優(yōu)化純水相中生產(chǎn)PS工藝,避免了有機相的使用。最佳反應條件下:PC60:L-絲氨酸1:10(g×g~(-1))、酶添加量500 U、反應溫度45℃、反應pH 5.5、反應時間6 h、氯化鈣添加量10%。反應6 h后,以PC60為底物,PS轉化率達到96.7%,PC剩余2.3%,副產(chǎn)物PA僅生成0.2%,底物向產(chǎn)物實現(xiàn)高效轉化。
【圖文】：

圖 1-1 PLD 家族的基本結構圖Fig. 1-1 Scheme of the basic structure of PLDs 和 Kerr 認為具有這四個保守基序的酶是上述 PLD 超家族成員[9]。在這分類是基于序列同源性提出的。第 I類包括來自真菌和高等真核生物的含。這些酶中有一些具有不同的 N 端序列，其中包括脂質(zhì)或鈣結合調(diào)控域 PLD 活性。第 II 類酶包括細菌 PLD，如鏈霉菌 PLD。第 III 類和第 IV 分成的酶、細菌心磷脂合成酶和磷脂酰絲氨酸合成酶。其余的分類則包含了的酶。第 V 類酶包括病毒 p37 和 K4。第 VII 類和第 VIII 類分別包括核內(nèi) D 結構家族成員如核酸內(nèi)切酶、細菌酶（Nuc[11]、BfiI、鏈霉菌 PMF-PLD[12]、的蛋白晶體結構目前已被報道。從現(xiàn)有的結構可以明顯看出，，PLD 超家存在保守折疊。

圖 1-2 鏈霉菌 PMF-PLD 的三維蛋白結構Fig. 1-2 Tertiary structures of PMF-PLD磷酸二酯酶活性，可以參與兩個反應[17]：（PA）。（2）催化磷脂酰膽堿與親核供體（PE）、磷脂酰肌醇（PI）和 PS 等稀基上，咪唑氮對底物磷原子進行親核攻團提供一個氫原子，形成一個五配位磷質(zhì)子，從而使附近的水或其他醇分子脫成磷脂或者 PA。
【學位授予單位】：江南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：Q78;Q55

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 王秀娟;高山;王國澤;;磷脂酶D的抗逆特性及其活性檢測研究[J];湖北農(nóng)業(yè)科學;2014年05期

2 姜芳燕;王金梅;戴大章;李春;;產(chǎn)磷脂酶菌株的篩選鑒定及其應用[J];化工學報;2012年03期

3 雷享亮;曾曉春;;水稻磷脂酶A活性測定方法的研究[J];江西農(nóng)業(yè)大學學報;2011年05期

4 趙紫薇;楊天奎;牟英;;磷脂酶D制備及應用的研究進展[J];糧油加工;2010年07期

5 李勇;盧萍;韓冰;;植物的磷脂酶D[J];內(nèi)蒙古林業(yè)科技;2009年01期

6 宋松;葛春艷;;磷脂酶D參與的植物信號轉導[J];安徽農(nóng)學通報(上半月刊);2009年19期

7 周艷;馬興銘;張曉梅;金鳳玲;鄧英;;白色念珠菌磷脂酶活性與其毒力因子關系的研究[J];中國微生態(tài)學雜志;2009年11期

8 劉奇;白麗;;白色念珠菌磷脂酶B的研究進展[J];中國熱帶醫(yī)學;2008年06期

9 王常高;劉彥昌;干信;陳濤;;Bacillus Mycoides磷脂酶C部分特性研究[J];化學與生物工程;2007年07期

10 楊寧;陳明鍇;任龍;何東平;陳濤;;重組磷脂酶C的研究[J];中國藥理學通報;2006年10期

相關會議論文 前10條

1 袁海英;陳力耕;李疆;;植物磷脂酶D的分子生物學特性[A];2005年全國學術年會農(nóng)業(yè)分會場論文專集[C];2005年

2 柏江;楊麗君;丁海新;肖強;;一種新的磷酯酰肌醇特異性磷脂酶C底物的合成及應用[A];中國化學會第28屆學術年會第19分會場摘要集[C];2012年

3 ;植物磷脂酶C和D在抗逆信號轉導中的分子機理[A];2017中國長三角遺傳學大會會議手冊[C];2017年

4 李軍紅;高榮娟;潘麗軍;姜紹通;;一株產(chǎn)磷脂酶細菌的篩選及其性質(zhì)研究[A];中國機械工程學會包裝與食品工程分會2010年學術年會論文集[C];2010年

5 柴曉杰;韓冬梅;叢玉婷;劉藝瓊;岳金榮;;鹽藻磷脂酶C基因的克隆及生物信息學分析[A];2016年中國水產(chǎn)學會學術年會論文摘要集[C];2016年

6 苗俊英;張紅衛(wèi);韓貽仁;;兩種磷脂酶C在血管內(nèi)皮細胞凋亡中的作用[A];中國細胞生物學學會第七次會議論文摘要匯編[C];1999年

7 江濤;;蜂毒素與磷脂酶相互作用機理的計算機模擬[A];中國毒理學會生物毒素毒理專業(yè)委員會第4次、中國生物化學與分子生物學會毒素專業(yè)組第5次學術研討會論文摘要[C];2001年

8 劉霞;王瑋瑋;石梅;張尚立;苗俊英;;磷脂酰膽堿特異性磷脂酶C和磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C對血管內(nèi)皮細胞凋亡的綜合調(diào)節(jié)[A];中國細胞生物學學會2005年學術大會、青年學術研討會論文摘要集[C];2005年

9 張芹;孫兆敏;徐杰;李兆杰;王玉明;薛長湖;;磷脂組成差異對磷脂酶D催化合成磷脂酰絲氨酸的影響[A];2014年中國水產(chǎn)學會學術年會論文摘要集[C];2014年

10 王克剛;;磷脂酶A_2在肺挫傷后肺水腫中的作用[A];中華醫(yī)學會急診醫(yī)學學會第六次全國急診醫(yī)學學術會議論文匯編[C];1996年

相關博士學位論文 前10條

1 李冰麟;磷脂酶D催化磷脂酰基轉移反應生產(chǎn)稀有及非天然磷脂的研究[D];西北大學;2019年

2 晁洪露;磷脂酶與脂質(zhì)組學在顱腦創(chuàng)傷中的作用機制研究[D];南京醫(yī)科大學;2018年

3 李先平;煙曲霉磷脂酶D基因敲除及其功能研究[D];青島大學;2012年

4 程洪強;人IB和X型磷脂酶A2蛋白的去折疊和重折疊[D];中國科學院研究生院（上海生命科學研究院）;2005年

5 黃立峰;舟山眼鏡蛇蛇毒磷脂酶A_2的分離及其對M型膽堿受體的作用[D];福建醫(yī)科大學;2007年

6 王道營;肌內(nèi)磷脂酶在傳統(tǒng)板鴨加工中對磷脂的降解作用研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學;2014年

7 白潔;磷脂酶C-γ_1和γ_2在鼠成纖維細胞血小板源性生長因子信號轉導中作用的研究[D];第一軍醫(yī)大學;2001年

8 王法微;水稻磷脂酶C調(diào)節(jié)耐鹽性以及磷脂酶D參與種子老化的研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學;2011年

9 占劍峰;磷脂酶A1的發(fā)酵制備、分離純化及催化特性的研究[D];合肥工業(yè)大學;2013年

10 趙晟;分泌型磷酯酶A_2及神經(jīng)酰胺誘導的細胞程序化死亡及其相關的信號傳導途徑[D];中國科學院研究生院（上海生命科學研究院）;2002年

相關碩士學位論文 前10條

1 李進紅;磷脂酶A_1和C的固定化及其在聯(lián)合脫膠中的應用[D];合肥工業(yè)大學;2019年

2 鮑賽;磁性納米粒子固定化磷脂酶及其在菜籽油脫膠中的應用[D];合肥工業(yè)大學;2019年

3 吳蕓;粘質(zhì)沙雷氏菌外膜磷脂酶A（A1）基因克隆、異源表達及其在菜籽油中脫膠研究[D];合肥工業(yè)大學;2019年

4 黃婷婷;磷脂酶D的重組優(yōu)化表達及生物轉化制備磷脂酰絲氨酸[D];江南大學;2019年

5 侯海娟;磷脂酶D的重組表達及其在磷脂酰絲氨酸合成中的應用[D];江南大學;2019年

6 萬燁;創(chuàng)傷弧菌磷脂酶VvPlpA的結構與功能研究[D];中國科學院大學(中國科學院海洋研究所);2019年

7 朱丹峰;磷脂酶產(chǎn)生菌的篩選、酶學性質(zhì)及應用研究[D];合肥工業(yè)大學;2018年

8 水龍龍;磷脂酶A_1的固定化及其在菜籽油脫膠中的應用[D];合肥工業(yè)大學;2018年

9 肖子謙;參與容積調(diào)控陰離子通道激活的磷脂酶C亞型的篩選[D];河北醫(yī)科大學;2018年

10 李薪;脂蛋白相關磷脂酶A2在2型糖尿病患者中的檢測意義[D];西安醫(yī)學院;2018年

本文編號：2607175