乳酰-N-新四糖(Lacto-N-neotetraose,LNnT)是人乳寡糖中重要的成分之一,具有增強人體免疫力,調(diào)節(jié)腸道菌群和促進細胞成熟等重要的生物學(xué)功能。已被歐洲食品安全局(EFSA)、歐盟(EU)和美國食品藥品管理局(FDA)批準可以作為營養(yǎng)強化劑添加到嬰幼兒配方食品中。目前,LNnT的商業(yè)化生產(chǎn)主要包括化學(xué)合成和生物合成兩種方法,其中生物合成法僅需以廉價的碳源和細胞內(nèi)可再生供體為原料,且以較低的環(huán)境代價獲得高經(jīng)濟產(chǎn)出,因此具有更為廣闊的應(yīng)用前景。LNnT(Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc)是由D-半乳糖、N-乙酰氨基葡萄糖、D-半乳糖和D-葡萄糖依次連接組成的線性四糖,其合成途徑較為復(fù)雜。目前生物合成法仍存在一些不足限制了產(chǎn)物的高效合成,如胞內(nèi)的合成前體供給不足、合成途徑與競爭途徑之間代謝流不平衡、代謝壓力過大可能影響菌株的遺傳穩(wěn)定性等。本論文以枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis,B.subtilis)為研究對象,通過引入外源基因構(gòu)建LNnT的合成途徑;利用模塊化工程優(yōu)化前體合成途徑,強化和平衡胞內(nèi)前體的供給;進一步通過構(gòu)建CRISPRi...

【文章頁數(shù)】：105 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略詞注釋表
第一章 緒論
    1.1 乳酰-N-新四糖概述
        1.1.1 乳酰-N-新四糖的性質(zhì)
        1.1.2 乳酰-N-新四糖的功能和應(yīng)用
        1.1.3 乳酰-N-新四糖及其衍生物的生產(chǎn)
    1.2 枯草芽孢桿菌概述
        1.2.1 枯草芽孢桿菌的特性及應(yīng)用
        1.2.2 B.subtilis發(fā)酵合成乳酰-N-新四糖分析
    1.3 代謝工程策略概述
        1.3.1 模塊化工程
        1.3.2 CRISPRi技術(shù)
        1.3.3 啟動子工程
    1.4 本論文主要研究內(nèi)容
        1.4.1 立題依據(jù)和研究意義
        1.4.2 本論文主要研究內(nèi)容
第二章 枯草芽孢桿菌中LNnT異源合成途徑的構(gòu)建
    2.1 前言
    2.2 實驗材料與方法
        2.2.1 菌株、質(zhì)粒和化學(xué)試劑
        2.2.2 構(gòu)建異源基因lgtA,lgtB游離表達質(zhì)粒
        2.2.3 整合表達異源基因lgtA,lgtB及 lacY
        2.2.4 敲除β-半乳糖苷酶基因yesZ
        2.2.5 過表達核苷二磷酸激酶基因ndk
        2.2.6 搖瓶發(fā)酵
        2.2.7 分析方法
    2.3 結(jié)果
        2.3.1 LNnT從頭合成途徑在B.subtilis中的構(gòu)建
        2.3.2 過表達lacY基因,敲除yesZ基因?qū)NnT合成的影響
        2.3.3 優(yōu)化關(guān)鍵基因lgtA和 lgtB對 LNnT產(chǎn)量的影響
        2.3.4 強化ndk基因?qū)NnT合成的影響
    2.4 討論
    2.5 本章小結(jié)
第三章 模塊途徑工程優(yōu)化LNnT合成代謝網(wǎng)絡(luò)
    3.1 前言
    3.2 實驗材料與方法
        3.2.1 菌株、質(zhì)粒和培養(yǎng)條件
        3.2.2 前體UDP-GlcNAc合成途徑關(guān)鍵酶驗證
        3.2.3 前體UDP-Gal合成途徑關(guān)鍵酶驗證
        3.2.4 優(yōu)化組裝前體模塊
        3.2.5 3-L發(fā)酵罐條件
        3.2.6 分析方法
    3.3 結(jié)果
        3.3.1 關(guān)鍵前體UDP-GlcNAc模塊的關(guān)鍵酶驗證
        3.3.2 關(guān)鍵前體UDP-Gal模塊的關(guān)鍵酶驗證
        3.3.3 兩個前體模塊的不同強度組裝對LNnT合成的影響
        3.3.4 3-L罐間歇補料發(fā)酵及連續(xù)補料發(fā)酵對LNnT合成的影響
    3.4 討論
    3.5 本章小結(jié)
第四章 基于CRISPRi系統(tǒng)的動態(tài)調(diào)控策略提高乳酰-N-四糖的合成
    4.1 前言
    4.2 實驗材料與方法
        4.2.1 菌株和培養(yǎng)條件
        4.2.2 sgRNA序列的設(shè)計
        4.2.3 構(gòu)建分別抑制pfkA,pyk,zwf和mnaA基因的sgRNA表達質(zhì)粒
        4.2.4 構(gòu)建多重抑制pfkA,pyk,zwf基因sgRNAs表達質(zhì)粒
        4.2.5 分析方法
    4.3 結(jié)果
        4.3.1 利用CRISPRi系統(tǒng)抑制競爭途徑中的單個基因?qū)NnT合成的影響
        4.3.2 多基因的抑制對LNnT合成的影響
        4.3.3 解除LNTII轉(zhuǎn)化為LNnT過程中的限速步驟
        4.3.4 不同誘導(dǎo)劑的添加時間和添加量對LNnT合成影響
        4.3.5 重組枯草芽孢桿菌的3-L罐連續(xù)補料發(fā)酵對LNnT合成的影響
    4.4 討論
    4.5 本章小結(jié)
第五章 基于啟動子工程的無質(zhì)粒和芽孢的LNnT合成菌株的構(gòu)建
    5.1 前言
    5.2 實驗材料與方法
        5.2.1 菌株、質(zhì)粒及培養(yǎng)條件
        5.2.2 基因組30個位點表達框構(gòu)建
        5.2.3 枯草芽孢桿菌內(nèi)源啟動子質(zhì)粒構(gòu)建
        5.2.4 流式細胞儀篩選突變啟動子
        5.2.5 基于啟動子工程的合成LNnT無質(zhì)粒工程菌的構(gòu)建
        5.2.6 Spo0A啟動子的突變構(gòu)建
        5.2.7 分析方法
    5.3 結(jié)果
        5.3.1 基因組不同整合位點的篩選和驗證
        5.3.2 枯草芽孢桿菌高表達強度的短啟動子文庫的構(gòu)建
        5.3.3 合成LNnT無質(zhì)粒枯草芽孢桿菌的構(gòu)建
        5.3.4 基于Spo0A啟動子改造策略的無芽孢枯草芽孢桿菌的構(gòu)建
    5.4 討論
    5.5 本章小結(jié)
主要結(jié)論及展望
    主要結(jié)論
    展望
論文創(chuàng)新點
致謝
參考文獻
附錄 Ⅰ:作者在攻讀博士學(xué)位期間相關(guān)成果清單
附錄 Ⅱ:論文中所用異源基因的核酸序列
附錄 Ⅲ:論文中所用的部分引物



本文編號：3861824