近年來,對水產(chǎn)品及其制品中的致敏原過敏的人群日益增多。由于缺乏有效的治療手段,避免攝入相關(guān)食物致敏原仍是預(yù)防食物過敏的主要途徑。這就需要對食品中潛在的致敏原進行快速高效的檢測及標識。精氨酸激酶（Arginine kinase,AK）是甲殼類食品的主要致敏原之一。目前,精氨酸激酶的檢測方法主要為PCR法和質(zhì)譜分析法。然而這兩種方法操作復(fù)雜,成本較高,且易出現(xiàn)假陽性結(jié)果。因此基于上述問題,本研究旨在構(gòu)建出一種操作簡單,準確靈敏,低廉環(huán)保的甲殼類精氨酸激酶檢測方法。研究的主要內(nèi)容如下:1、本文通過硫酸銨沉淀法及陰離子交換柱純化得到精氨酸激酶;液相質(zhì)譜聯(lián)用法鑒定該蛋白為凡納濱對蝦中的精氨酸激酶;MALDI-TOF測定其分子量為39675 Da。對提取的精氨酸激酶的氨基酸組成進行分析,顯示含量最高的氨基酸分別為天冬氨酸、谷氨酸和賴氨酸。通過紫外可見光光譜結(jié)果顯示精氨酸激酶在210 nm和280 nm具有兩個特征吸收峰。通過圓二色光譜結(jié)果顯示,精氨酸激酶的二級結(jié)構(gòu)中α螺旋占64%,β片層占11%,其余占25%。通過ELISA分析法證明提取的精氨酸激酶具有致敏性。通過多方面實驗確定精氨酸激酶的結(jié)構(gòu)及... 

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【學位級別】：碩士

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第1章 引言
    1.1 甲殼類水產(chǎn)品過敏及檢測概況
        1.1.1 甲殼類致敏原的過敏反應(yīng)機制
        1.1.2 甲殼類主要致敏原
        1.1.3 甲殼類致敏原檢測方法研究進展
    1.2 核酸適配體在食品安全檢測中的應(yīng)用進展
        1.2.1 核酸適配體概述
        1.2.2 核酸適配體在食品安全檢測中的應(yīng)用進展
    1.3 聚多巴胺在生物傳感中的應(yīng)用進展
        1.3.1 聚多巴胺概述
        1.3.2 聚多巴胺在生物傳感中的應(yīng)用進展
    1.4 主要研究內(nèi)容與意義
        1.4.1 研究意義及目的
        1.4.2 研究內(nèi)容
        1.4.3 技術(shù)路線
第2章 精氨酸激酶純化、鑒定及結(jié)構(gòu)分析
    2.1 前言
    2.2 儀器與試劑
        2.2.1 實驗儀器
        2.2.2 材料與試劑
        2.2.3 溶液的配制
    2.3 實驗方法
        2.3.1 精氨酸激酶的粗提
        2.3.2 精氨酸激酶的純化
        2.3.3 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)電泳分析
        2.3.4 精氨酸激酶質(zhì)譜鑒定
        2.3.5 精氨酸激酶紫外光譜分析
        2.3.6 精氨酸激酶結(jié)構(gòu)分析
        2.3.7 酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)
    2.4 結(jié)果與討論
        2.4.1 精氨酸激酶的提純
        2.4.2 SDS-PAGE分析精氨酸激酶純度
        2.4.3 精氨酸激酶質(zhì)譜分析
        2.4.4 紫外可見光光譜分析
        2.4.5 精氨酸激酶結(jié)構(gòu)分析
        2.4.6 精氨酸激酶免疫原性分析
    2.5 小結(jié)
第3章 磁珠-SELEX篩選精氨酸激酶核酸適配體
    3.1 前言
    3.2 儀器與試劑
        3.2.1 實驗儀器
        3.2.2 材料與試劑
        3.2.3 溶液的配制
        3.2.4 隨機核苷酸文庫和引物的構(gòu)建
    3.3 實驗方法
        3.3.1 AK與氨基磁珠的偶聯(lián)
        3.3.2 SELEX體外篩選
        3.3.3 PCR擴增體系和反應(yīng)條件優(yōu)化
        3.3.4 適配體的克隆、測序
        3.3.5 核酸適配體的親和性試驗
        3.3.6 核酸適配體的特異性試驗
    3.4 結(jié)果與討論
        3.4.1 AK偶聯(lián)磁珠的表征
        3.4.2 磁珠-SELEX篩選條件優(yōu)化
        3.4.3 篩選輪數(shù)的確定
        3.4.4 測序結(jié)果分析及二級結(jié)構(gòu)預(yù)測
        3.4.5 核酸適配體親和力測定
        3.4.6 核酸適配體特異性分析
    3.5 小結(jié)
第4章 聚多巴胺-熒光適配體傳感器在甲殼類精氨酸激酶檢測中的應(yīng)用
    4.1 前言
    4.2 儀器與試劑
        4.2.1 實驗儀器
        4.2.2 材料與試劑
        4.2.3 溶液配制
    4.3 實驗方法
        4.3.1 聚多巴胺的合成及表征
        4.3.2 聚多巴胺探針的合成
        4.3.3 方法學考察
        4.3.4 樣品預(yù)處理
        4.3.5 實際樣品的檢測
    4.4 結(jié)果與討論
        4.4.1 聚多巴胺的合成及理化性質(zhì)表征
        4.4.2 聚多巴胺探針的構(gòu)建與優(yōu)化
        4.4.3 生物傳感器的構(gòu)建表征及方法學考察
        4.4.5 實際樣品的蛋白分析及精氨酸激酶的檢測
    4.5 小結(jié)
第5章 結(jié)論與展望
    5.1 總結(jié)
    5.2 創(chuàng)新點
    5.3 展望
參考文獻
致謝



本文編號：3724676