炎癥是一種針對(duì)感染或損傷的適應(yīng)性免疫反應(yīng)。適度的炎癥反應(yīng)對(duì)機(jī)體是有益的,但當(dāng)發(fā)生失調(diào)慢性炎癥反應(yīng)時(shí),會(huì)引起一系列慢性疾�。ò┌Y,動(dòng)脈粥樣硬化,類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等）。免疫球蛋白G（Ig G）是一種從健康哺乳動(dòng)物血液中獲得的抗體,在脂多糖/植物凝集素誘導(dǎo)的細(xì)胞模型系統(tǒng)中表現(xiàn)出顯著的抗炎癥效果。雞蛋黃來源卵黃免疫球蛋白（IgY）在結(jié)構(gòu)和Ig G功能上相似,但是IgY比Ig G獲取的原材料簡(jiǎn)單,產(chǎn)量高,具有對(duì)哺乳動(dòng)物抗原有很高的親和力以及不與類風(fēng)濕因子反應(yīng)等特點(diǎn)。其IgY粗提物廣泛用于免疫活性和抗炎癥活性中。然而IgY的Fc片段不能激活哺乳動(dòng)物體系相應(yīng)的免疫調(diào)控機(jī)制,提高了IgY成為哺乳動(dòng)物過敏原的風(fēng)險(xiǎn)。目前用來分離純化Fab和Fc片段方法常常多種色譜柱的聯(lián)合使用,方法昂貴復(fù)雜且費(fèi)時(shí)。因此本論文在研究?jī)煞N蛋白酶酶解IgY活性片段的基礎(chǔ)上,提出了一種高效,綠色環(huán)保的Fab片段分離純化方法,制備高純度Fab片段。比較Fab片段和IgY結(jié)構(gòu)的差異,進(jìn)一步闡述Fab片段和IgY在LPS（脂多糖）誘導(dǎo)的RAW264.5炎癥模型中的抗炎癥功效。研究?jī)?nèi)容結(jié)果如下:第一,本章研究了木瓜蛋白酶和胃蛋白酶分解IgY得... 

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略語(yǔ)表
第一章 緒論
    1 IgY的結(jié)構(gòu)與活性片段
    2 Fab和Fc片段的制備
        2.1 IgY的酶解方式
            2.2.1 木瓜蛋白酶酶解
            2.2.2 胃蛋白酶酶解
        2.2 Fab片段和Fc片段的分離純化
            2.2.1 鹽析
            2.2.2 超濾法
            2.2.3 色譜法
            2.2.4 Gradiflow技術(shù)
    3 IgY及其Fab片段抗炎癥活性研究
        3.1 炎癥的形成機(jī)理
        3.2 巨噬細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)
        3.3 哺乳動(dòng)物免疫球蛋白IVIg和巨噬細(xì)胞的相互作用
            3.3.1 IVIg與巨噬細(xì)胞的膜表面受體的相互作用
            3.3.2 血紅素加氧酶-1通路
            3.3.3 IVIg毒中和作用
        3.4 Fab的抗炎癥活性研究
        3.5 IgY的應(yīng)用研究進(jìn)展
    4 選題意義
    5 研究?jī)?nèi)容
第二章 兩種蛋白酶酶解制備IgY活性片段研究
    1 材料與方法
        1.1 材料與試劑
        1.2 主要儀器
        1.3 試驗(yàn)方法
            1.3.1 IgY的制備
            1.3.2 IgY的表征
            1.3.2 蛋白質(zhì)的木瓜蛋白酶酶解條件優(yōu)化
            1.3.3 胃蛋白酶酶解條件優(yōu)化
            1.3.4 Western blotting試驗(yàn)
            1.3.5 胃蛋白酶解制備Fab片段的分離純化
    2 結(jié)果與分析
        2.1 IgY非還原型SDS-PAGE電泳圖
        2.2 SEC-HPLC分析IgY樣品純度
        2.3 木瓜蛋白酶酶解條件優(yōu)化
            2.3.1 IgY和木瓜蛋白酶用量比
            2.3.2 半胱氨酸的用量
            2.3.3 酶解時(shí)間
            2.3.4 酶解條件的優(yōu)化
        2.4 胃蛋白酶酶解條件優(yōu)化
            2.4.1 IgY與胃蛋白酶質(zhì)量比對(duì)酶解效率的影響
            2.4.2 酶解時(shí)間對(duì)酶解效率的影響
        2.5 酶解溶液的western blotting分析
        2.6 胃蛋白酶解制備Fab片段的分離純化
    3 討論
    4 本章小結(jié)
第三章 IgY木瓜蛋白酶酶解Fab片段的分離純化
    1 材料與方法
        1.1 材料與試劑
        1.2 主要儀器
        1.3 試驗(yàn)方法
            1.3.1 酶解溶液的制備
            1.3.2 IgY酶解溶液的超濾濃縮
            1.3.3 硫酸銨和氯化鈉鹽析對(duì)木瓜蛋白酶酶解溶液的影響
            1.3.4 陰離子交換色譜柱分離IgY木瓜蛋白酶酶解片段
            1.3.5 SDS-PAGE分析
            1.3.6 蛋白質(zhì)濃度測(cè)定
            1.3.7 Western blotting分析
            1.3.8 MALDI-TOF/TOF MS分析
    2 結(jié)果與討論
        2.1 超濾對(duì)IgY木瓜蛋白酶酶解片段的影響
        2.2 鹽析對(duì)IgY木瓜蛋白酶酶解溶液的影響
        2.3 陰離子交換色譜柱分離IgY木瓜蛋白酶酶解片段
            2.3.1 離子強(qiáng)度對(duì)陰離子交換色譜柱分離效果的影響
            2.3.2 pH值對(duì)陰離子交換色譜柱分離效果的影響
            2.3.3 IgY木瓜蛋白酶酶解片段的分離純化
            2.3.4 MALDI-TOF/TOF MS定性未知片段
        2.4 IgY酶解片段純度和得率計(jì)算
    3 討論
    4 小結(jié)
第四章 IgY及 Fab片段的蛋白構(gòu)象與理化性質(zhì)研究
    1 材料與方法
        1.1 材料
            1.1.1 主要試劑
            1.1.2 主要儀器
        1.2 方法
            1.2.1 傅里葉變換紅外光譜(FTIR)
            1.2.2 圓二色譜(CD)分析
            1.2.3 差示掃描量熱分析(DSC)
            1.2.4 紫外可見(UV-Vis)光譜掃描
            1.2.5 內(nèi)源性熒光光譜分析
            1.2.6 表面疏水性的測(cè)定
            1.2.7 分子排阻色譜分析(SEC-HPLC)
            1.2.8 動(dòng)態(tài)光散射(DLS)粒徑分析
            1.2.9 Zeta電位測(cè)定
            1.2.10 數(shù)據(jù)分析
    2 結(jié)果與分析
        2.1 傅里葉變換紅外光譜分析
        2.2 圓二色譜分析
        2.3 差示掃描量熱分析
        2.4 熒光光譜分析
        2.5 紫外光譜分析
        2.6 蛋白質(zhì)表面疏水性
        2.7 蛋白質(zhì)的SEC-HPLC分析
        2.8 粒徑分布
        2.9 蛋白表面電荷分析
    3 討論
    4 本章小結(jié)
第五章 IgY及 Fab片段對(duì)脂多糖誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞的炎癥的影響
    1 材料與方法
        1.1 材料
            1.1.1 主要試劑
            1.1.2 主要儀器
        1.2 方法
            1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)
            1.2.2 細(xì)胞活性的測(cè)定
            1.2.3 炎癥因子的測(cè)定
            1.2.4 RT-PCR分析
            1.2.5 數(shù)據(jù)分析
    2 結(jié)果與分析
        2.1 RAW264.7巨噬細(xì)胞培養(yǎng)
        2.2 細(xì)胞活性的測(cè)定
        2.3 LPS誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞的活性
        2.4 一氧化氮(NO)的測(cè)定
        2.5 前列腺素E2(PGE2)含量的測(cè)定
        2.6 COX-2 mRNA表達(dá)
        2.7 iNOS mRNA的表達(dá)
        2.8 TNF-α含量的測(cè)定
        2.9 IL-6含量的測(cè)定
        2.10 IL-10含量的測(cè)定
    3 討論
    4 小結(jié)
第六章 Fab片段對(duì)NF-κB和 MAPK信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的調(diào)控
    1 材料與方法
        1.1 材料
            1.1.1 主要試劑
            1.1.2 主要儀器
        1.2 方法
            1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)
            1.2.2 細(xì)胞活性測(cè)定
            1.2.3 qRT-PCR
            1.2.4 NF-κB和 MAPKs通路調(diào)節(jié)蛋白檢測(cè)
            1.2.5 激光共聚焦分析
            1.2.6 數(shù)據(jù)分析
    2 結(jié)果與分析
        2.1 細(xì)胞活性的測(cè)定
        2.2 qRT-PCR
        2.3 激光共聚焦分析
        2.4 NF-κB和 MAKPs調(diào)節(jié)蛋白檢測(cè)
    3 討論
    4 小結(jié)
第七章 結(jié)論與展望
    1 結(jié)論
    2 創(chuàng)新點(diǎn)
    3 展望
參考文獻(xiàn)
附錄 攻讀碩士學(xué)位期間研究成果
致謝



本文編號(hào)：3693925