農(nóng)產(chǎn)品典型真菌毒素生物識別材料與快速檢測方法研究
發(fā)布時間：2021-11-13 12:39
真菌毒素危害大、防控難,威脅農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全。開展農(nóng)產(chǎn)品真菌毒素現(xiàn)場快速檢測技術(shù)研究,及時發(fā)現(xiàn)污染,是防止真菌毒素進入食物鏈的重要手段。目前快檢技術(shù)主要面臨的挑戰(zhàn)表現(xiàn)在:部分真菌毒素高親和力抗體匱乏、多種類風險因子同步檢測難、速測產(chǎn)品抗干擾性差。針對上述問題,本學位論文研制出高靈敏高特異性單克隆抗體、納米抗體,改良了核酸模擬抗體（適配體）等生物識別材料;并基于三種識別材料依次建立了系列真菌毒素快速檢測技術(shù),用于糧油、乳品、水果等不同農(nóng)產(chǎn)品中典型真菌毒素的高靈敏檢測。論文最后,系統(tǒng)分析了這三類主要識別材料的應用特性及在快檢產(chǎn)品開發(fā)中應用前景。具體研究結(jié)果如下:（1）研制出伏馬毒素B1（FB1）、二乙酰鑣草鐮刀菌烯醇（DAS）等系列單克隆抗體（mAb）,建立了糧油中FB1灰度成像、真菌毒素與農(nóng)殘同步側(cè)向流層析,及基于新型納米仿生催化材料的DAS免疫氣壓傳感檢測方法。（1）研制出FB1單克隆抗體7A11,半抑制濃度（IC50）為0.66 ng/mL。建立了兩類結(jié)果輸出方式的現(xiàn)場快速檢測方法:基于納米金比色定性方法與灰度成像定量方...
【文章來源】：中國農(nóng)業(yè)科學院北京市
【文章頁數(shù)】：168 頁
【學位級別】：博士
【部分圖文】：
常見真菌毒素的化學結(jié)構(gòu)式Fig.1-1ChemicalstructureofmycotoxinFumonisinB1
缺揮糜諉庖呱?锎?醒芯俊?單域重鏈抗體也被稱為納米抗體，其來源于駱駝科或者軟骨魚類體內(nèi)的重鏈抗體可變區(qū)部分。納米抗體是目前發(fā)現(xiàn)具有抗原識別能力的最小抗體，分子量僅為15-17kDa，遠小于單克隆抗體的150kDa。納米抗體通過擴增重鏈抗體自然存在的兩種免疫球蛋白亞型IgG2和IgG3的可變區(qū)（VHH）基因片段，重組入噬菌粒中并轉(zhuǎn)化至抑制型E.coli感受態(tài)細胞，通過輔助噬菌體作用后重新組裝、分泌到體外，形成噬菌體展示納米抗體庫。經(jīng)過數(shù)輪“吸附-洗脫-富集”的生物篩選方法篩選出能夠特異結(jié)合靶標分子的噬菌體展示納米抗體（圖1-2）。納米抗體的抗原結(jié)合位點的突起結(jié)構(gòu)能識別靶標物凹陷、裂隙表位，提高了對靶標物的結(jié)合能力和多樣性；納米抗體具有的柔性結(jié)構(gòu)可在高溫后折疊恢復結(jié)構(gòu)，具有更好的熱穩(wěn)定性，能夠耐受70℃高溫，在37℃或者4℃條件下儲藏數(shù)月仍可保持活性，在-20℃條件下可保存更久(DUMOULINetal.,2009)。抗獨特型納米抗體（anti-idiotypeantibody,AIdnb）是利用單克隆抗體免疫羊駝獲得針對抗體可變區(qū)的抗原特異表位群抗抗體，AId不僅具有特穩(wěn)性，還可作為抗原的替代物。圖1-2納米抗體的篩選過程(ROTHBAUER,2018)Fig.1-2SchematicmethodtogeneratenanobodyWANG等通過噬菌體展示庫篩選出了黃曲霉毒素抗獨特性納米抗體替代抗原，用于間接競爭ELISA方法檢測(WANGetal.,2013a)。He等研制了黃曲霉毒素特異性納米抗體，可耐有機溶劑及高溫，其可應用于ELISA方法檢測農(nóng)產(chǎn)品中黃曲霉毒素含量，靈敏度達到0.754ng/mL(HEetal.,2014)。Tang等建立了基于玉米赤霉烯酮和黃曲霉毒素抗獨特型納米抗體的真菌毒素多組分免疫層析方法(TANGetal.,2017)。此外，納米抗體還可以進行化學改性固定在傳感器表面(SAERENSetal.,2005)，接枝于納米顆粒(VANDEBROE
中國農(nóng)業(yè)科學院博士學位論文第一章引言8圖1-3核酸適配體SELEX篩選過程(KIMandGU,2013)Fig.1-3SELEXtechnologyaptamerscreeningprocess基于核酸適配體的生物傳感器在1996年被首次提出，并且被應用于各種小分子尤其是真菌毒素的檢測(WANGetal.,2019;YANGetal.,2017;ZHUetal.,2019)。2008年Cruz-aguado和Penner篩選出首個真菌毒素核酸適配體（可識別OTA的核酸適配體）。隨后OTA核酸適配體的結(jié)構(gòu)特性以及應用研究被更多學者所關(guān)注。2011年，Yang等發(fā)現(xiàn)在20mM二價鈣離子溶液中，OTA的親和力更高。通過圓二色譜方法發(fā)現(xiàn)，OTA可使核酸適配體由隨機卷曲結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)榫o密的剛性反平行G-四鏈體結(jié)構(gòu)(YANGetal.,2012;YANGetal.,2011)。2010年，經(jīng)過18輪SELEX篩選，最終研制出六個對FB1有親和力的核酸適配體序列。其中FB1-39的解離常數(shù)為100±30nM(MCKEAGUEetal.,2010)，該項研究為核酸適配體傳感器和基于核酸適配體的固相萃取柱的面市提供了可能。NeoventuresBiotechnologyInc.公司獲得了AFB1和ZEN核酸適配體專利，親和力為10nM，并研制出基于核酸適配體的側(cè)向流層析傳感器用于檢測OTA，AFB1和ZEN。（3）分子印記聚合物分子印記聚合物（Molecularlyimprintedpolymer，MIP）是一種可應用于傳感器、醫(yī)療設備等領(lǐng)域的識別組件，不僅可識別毒素等小分子物質(zhì)，還可以識別蛋白質(zhì)、病毒和微生物等(UZUNL,2016;WACKERLIG,2015)。在聚合物合成過程中，形成聚合物的官能團與模板分子相互作用，在聚合物形成后模板分子被移除，留下具有特定結(jié)合位點的聚合物材料（圖1-4）。MIP具有許多不同的合成技術(shù)。常用的是非共價印記方法，具體可描述為印跡分子與功能單體之間以離子鍵、氫鍵、范德華力等非共價鍵相互作用，包括本體聚合、沉淀聚合、微乳液聚合、固相印記、核殼印跡
【參考文獻】：
期刊論文
[1]A simple aptamer molecular beacon assay for rapid detection of aflatoxin B1[J]. Chao Wang,Linlin Sun,Qiang Zhao. Chinese Chemical Letters. 2019(05)
[2]毛細管電泳篩選鹽酸克倫特羅核酸適配體的方法研究[J]. 楊歌,朱超,劉曉慧,王勇,屈鋒. 分析化學. 2018(10)
博士論文
[1]黃曲霉毒素雜交瘤細胞株的選育及免疫層析檢測技術(shù)研究[D]. 張道宏.中國農(nóng)業(yè)科學院 2011
本文編號：3493035
【文章來源】：中國農(nóng)業(yè)科學院北京市
【文章頁數(shù)】：168 頁
【學位級別】：博士
【部分圖文】：
常見真菌毒素的化學結(jié)構(gòu)式Fig.1-1ChemicalstructureofmycotoxinFumonisinB1
缺揮糜諉庖呱?锎?醒芯俊?單域重鏈抗體也被稱為納米抗體，其來源于駱駝科或者軟骨魚類體內(nèi)的重鏈抗體可變區(qū)部分。納米抗體是目前發(fā)現(xiàn)具有抗原識別能力的最小抗體，分子量僅為15-17kDa，遠小于單克隆抗體的150kDa。納米抗體通過擴增重鏈抗體自然存在的兩種免疫球蛋白亞型IgG2和IgG3的可變區(qū)（VHH）基因片段，重組入噬菌粒中并轉(zhuǎn)化至抑制型E.coli感受態(tài)細胞，通過輔助噬菌體作用后重新組裝、分泌到體外，形成噬菌體展示納米抗體庫。經(jīng)過數(shù)輪“吸附-洗脫-富集”的生物篩選方法篩選出能夠特異結(jié)合靶標分子的噬菌體展示納米抗體（圖1-2）。納米抗體的抗原結(jié)合位點的突起結(jié)構(gòu)能識別靶標物凹陷、裂隙表位，提高了對靶標物的結(jié)合能力和多樣性；納米抗體具有的柔性結(jié)構(gòu)可在高溫后折疊恢復結(jié)構(gòu)，具有更好的熱穩(wěn)定性，能夠耐受70℃高溫，在37℃或者4℃條件下儲藏數(shù)月仍可保持活性，在-20℃條件下可保存更久(DUMOULINetal.,2009)。抗獨特型納米抗體（anti-idiotypeantibody,AIdnb）是利用單克隆抗體免疫羊駝獲得針對抗體可變區(qū)的抗原特異表位群抗抗體，AId不僅具有特穩(wěn)性，還可作為抗原的替代物。圖1-2納米抗體的篩選過程(ROTHBAUER,2018)Fig.1-2SchematicmethodtogeneratenanobodyWANG等通過噬菌體展示庫篩選出了黃曲霉毒素抗獨特性納米抗體替代抗原，用于間接競爭ELISA方法檢測(WANGetal.,2013a)。He等研制了黃曲霉毒素特異性納米抗體，可耐有機溶劑及高溫，其可應用于ELISA方法檢測農(nóng)產(chǎn)品中黃曲霉毒素含量，靈敏度達到0.754ng/mL(HEetal.,2014)。Tang等建立了基于玉米赤霉烯酮和黃曲霉毒素抗獨特型納米抗體的真菌毒素多組分免疫層析方法(TANGetal.,2017)。此外，納米抗體還可以進行化學改性固定在傳感器表面(SAERENSetal.,2005)，接枝于納米顆粒(VANDEBROE
中國農(nóng)業(yè)科學院博士學位論文第一章引言8圖1-3核酸適配體SELEX篩選過程(KIMandGU,2013)Fig.1-3SELEXtechnologyaptamerscreeningprocess基于核酸適配體的生物傳感器在1996年被首次提出，并且被應用于各種小分子尤其是真菌毒素的檢測(WANGetal.,2019;YANGetal.,2017;ZHUetal.,2019)。2008年Cruz-aguado和Penner篩選出首個真菌毒素核酸適配體（可識別OTA的核酸適配體）。隨后OTA核酸適配體的結(jié)構(gòu)特性以及應用研究被更多學者所關(guān)注。2011年，Yang等發(fā)現(xiàn)在20mM二價鈣離子溶液中，OTA的親和力更高。通過圓二色譜方法發(fā)現(xiàn)，OTA可使核酸適配體由隨機卷曲結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)榫o密的剛性反平行G-四鏈體結(jié)構(gòu)(YANGetal.,2012;YANGetal.,2011)。2010年，經(jīng)過18輪SELEX篩選，最終研制出六個對FB1有親和力的核酸適配體序列。其中FB1-39的解離常數(shù)為100±30nM(MCKEAGUEetal.,2010)，該項研究為核酸適配體傳感器和基于核酸適配體的固相萃取柱的面市提供了可能。NeoventuresBiotechnologyInc.公司獲得了AFB1和ZEN核酸適配體專利，親和力為10nM，并研制出基于核酸適配體的側(cè)向流層析傳感器用于檢測OTA，AFB1和ZEN。（3）分子印記聚合物分子印記聚合物（Molecularlyimprintedpolymer，MIP）是一種可應用于傳感器、醫(yī)療設備等領(lǐng)域的識別組件，不僅可識別毒素等小分子物質(zhì)，還可以識別蛋白質(zhì)、病毒和微生物等(UZUNL,2016;WACKERLIG,2015)。在聚合物合成過程中，形成聚合物的官能團與模板分子相互作用，在聚合物形成后模板分子被移除，留下具有特定結(jié)合位點的聚合物材料（圖1-4）。MIP具有許多不同的合成技術(shù)。常用的是非共價印記方法，具體可描述為印跡分子與功能單體之間以離子鍵、氫鍵、范德華力等非共價鍵相互作用，包括本體聚合、沉淀聚合、微乳液聚合、固相印記、核殼印跡
【參考文獻】：
期刊論文
[1]A simple aptamer molecular beacon assay for rapid detection of aflatoxin B1[J]. Chao Wang,Linlin Sun,Qiang Zhao. Chinese Chemical Letters. 2019(05)
[2]毛細管電泳篩選鹽酸克倫特羅核酸適配體的方法研究[J]. 楊歌,朱超,劉曉慧,王勇,屈鋒. 分析化學. 2018(10)
博士論文
[1]黃曲霉毒素雜交瘤細胞株的選育及免疫層析檢測技術(shù)研究[D]. 張道宏.中國農(nóng)業(yè)科學院 2011
本文編號：3493035
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