嗜鹽古菌是古菌域中一類(lèi)喜好高鹽的微生物,廣泛分布于各種高鹽環(huán)境中。嗜鹽古菌所分泌蛋白酶因其耐鹽堿、耐高溫和耐有機(jī)溶劑等性質(zhì),具有優(yōu)良的應(yīng)用潛力和重要研究?jī)r(jià)值。鹽漬海帶作為一種高鹽市售食品,其中含有豐富多樣的嗜鹽古菌和高產(chǎn)胞外蛋白酶菌株資源。本文針對(duì)產(chǎn)自4個(gè)不同沿海地區(qū)的鹽漬海帶,從高通量測(cè)序、嗜鹽古菌分離、產(chǎn)胞外蛋白酶菌株篩選、多相分類(lèi)學(xué)鑒定、基因組測(cè)序、疑似蛋白酶基因功能驗(yàn)證與蛋白酶的異源表達(dá)和純化、酶學(xué)性質(zhì)表征等方面開(kāi)展研究,聚焦鹽漬海帶中嗜鹽古菌的多樣性、產(chǎn)胞外蛋白酶新種的特性與分類(lèi)學(xué)地位、嗜鹽蛋白酶酶學(xué)性質(zhì)以及嗜鹽蛋白酶C端延伸區(qū)（C-terminal extension,CTE）結(jié)構(gòu)域功能,以期為產(chǎn)嗜鹽蛋白酶菌株與嗜鹽蛋白酶的開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。首先,以遼寧大連（DLLS）、山東榮成（RC）、江蘇連云港（LYG）、福建霞浦（XP）生產(chǎn)鹽漬海帶為研究對(duì)象,通過(guò)高通量測(cè)序分別獲得154、152、139和61個(gè)OTU。從DLLS樣品分離獲得85株嗜鹽古菌分屬于15個(gè)屬的25個(gè)種,從RC樣品分離獲得87株嗜鹽古菌分屬于14個(gè)屬的29個(gè)種,從LYG樣品分離獲得83株嗜鹽古菌分屬于13... 

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【學(xué)位級(jí)別】：博士

【部分圖文】：

嗜鹽古菌從門(mén)水平到屬水平的分類(lèi)Figure1.1ClassificationofHaloarchaeafromphylumtogenus[56]

鹽漬海帶中嗜鹽古菌多樣性及其胞外蛋白酶研究41.1.5嗜鹽古菌蛋白的耐鹽機(jī)制特定蛋白質(zhì)的最終結(jié)構(gòu)和功能取決于蛋白質(zhì)的核心和表面殘基與溶解蛋白質(zhì)的溶劑之間的相互作用[57]。高鹽條件下疏水相互作用通常引起蛋白質(zhì)的溶解度、結(jié)合能力、穩(wěn)定性、結(jié)晶性、蛋白質(zhì)聚集和沉淀等性質(zhì)發(fā)生變化[58,59]，使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)在高鹽濃度下不穩(wěn)定。但是鹽的存在對(duì)于維持嗜鹽蛋白質(zhì)/酶的活性構(gòu)象至關(guān)重要[60]。一些研究發(fā)現(xiàn)，在低濃度的鹽或無(wú)鹽時(shí)嗜鹽蛋白的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和酶活性喪失[60,61]。嗜鹽蛋白具體耐鹽機(jī)制有三類(lèi)：（1）嗜鹽蛋白特殊的氨基酸組成嗜鹽蛋白的特殊氨基酸組成是其在高濃度鹽溶液中具有高溶解性和對(duì)有機(jī)溶劑的抗性的關(guān)鍵原因[62]。由于酸性氨基酸的水合羧基，使嗜鹽蛋白表面帶有負(fù)電荷。表面的負(fù)電荷被大量的陽(yáng)離子屏蔽，這可防止蛋白展開(kāi)并保持其溶解度[58,60,63,64]（圖1.2）。嗜鹽微生物的蛋白質(zhì)的酸性氨基酸比例相對(duì)較高，如絲氨酸、蘇氨酸[65]、天冬氨酸、谷氨酸[66]、丙氨酸、纈氨酸[61,67]。此外，嗜鹽蛋白還包含少量的非極性氨基酸，如半胱氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴(lài)氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸和纈氨酸殘基[61,66,67]。此特征還與嗜鹽蛋白的低pI值（4.2至6.8）有關(guān)[68-70]。圖1.2嗜鹽蛋白的鹽穩(wěn)定性Figure1.2Saltstabilityofhalophilicproteins[71]注：（A）酸性氨基酸賦予蛋白質(zhì)表面帶負(fù)電荷的酶/蛋白質(zhì)（變性構(gòu)象）；（B）蛋白質(zhì)表面的負(fù)電荷被陽(yáng)離子中和，例如Na+（活性構(gòu)象）。

鹽漬海帶中嗜鹽古菌多樣性及其胞外蛋白酶研究10C450_13147[121]。部分嗜鹽古菌卻不能產(chǎn)胞外蛋白酶，從Haloarculamarismortui的完整基因組序列并沒(méi)有預(yù)測(cè)出halolysin基因[122]。已發(fā)現(xiàn)的嗜鹽古菌胞外蛋白酶都可被絲氨酸蛋白酶抑制劑（如苯基甲基磺酰氟PMSF，氟磷酸二異丙酯DFP）和枯草桿菌蛋白酶特異性抑制劑（如鏈霉菌的枯草桿菌蛋白酶抑制劑，ovomucoid卵類(lèi)粘液）抑制而失活（表1.1）。結(jié)合對(duì)已有基因序列的嗜鹽古菌胞外蛋白酶分析，嗜鹽古菌胞外蛋白酶是絲氨酸蛋白酶，并且均為枯草桿菌蛋白酶類(lèi)蛋白酶（subtilase），絲氨酸蛋白酶亞家族S8A成員（COG1404），被稱(chēng)為halolysin。目前已知蛋白序列的嗜鹽古菌蛋白酶都是由4部分結(jié)構(gòu)域組成，分別為信號(hào)肽、N端前肽、絲氨酸蛋白酶家族催化結(jié)構(gòu)域和C端延伸區(qū)結(jié)構(gòu)域（CTE）。1.3.2Halolysin自催化成熟機(jī)制圖1.3halolysin的自催化成熟機(jī)制Figure1.3Autocatalyticmaturationmechanismofhalolysin[123,124]注：（a）圖為Nep自催化成熟示意圖；（b）圖為SptA自催化成熟示意圖。Halolysin自催化成熟機(jī)制在SptA和Nep中有過(guò)詳細(xì)報(bào)道，與大多數(shù)subtilase一樣，都是由蛋白酶前體自催化逐步切割成熟[123,124]（圖1.3），不同的是最后的成熟酶包含催化結(jié)構(gòu)域和CTE結(jié)構(gòu)域。halolysin的信號(hào)肽含有雙精氨酸基序（RR）為T(mén)at信號(hào)肽，Tat途徑能夠轉(zhuǎn)運(yùn)完全折疊的蛋白質(zhì)[125]。halolysin前體在胞內(nèi)部分折疊或完全折疊，經(jīng)Tat途徑分泌到胞外，該過(guò)程中信號(hào)肽被切除，形成蛋白酶酶原。去除信號(hào)肽對(duì)于Nep的自催化成熟可能是必要的[124]，但對(duì)于SptA激活不是必需的[123]。N端前肽在蛋白酶中作為分子伴侶幫助酶原正確折疊，同時(shí)

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]我國(guó)鮮海帶加工的綜合利用[J]. 李曉川.  中國(guó)水產(chǎn). 2012(10)

博士論文
[1]嗜鹽蛋白酶SptC的成熟機(jī)制及其幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域功能的研究[D]. 張瑤心.武漢大學(xué) 2014
[2]極端嗜鹽古菌Tat途徑底物SptA的成熟與分泌機(jī)制研究[D]. 杜欣.武漢大學(xué) 2014

碩士論文
[1]大連鹽場(chǎng)與茶卡鹽湖嗜鹽古菌多樣性及胞外蛋白酶研究[D]. 李楊.江蘇大學(xué) 2018
[2]新疆地區(qū)鹽堿環(huán)境嗜鹽古菌多樣性與產(chǎn)胞外蛋白酶研究[D]. 周瑤.江蘇大學(xué) 2018
[3]風(fēng)味蛋白酶酶解海帶制備海鮮調(diào)味料的研究[D]. 張曉羽.大連工業(yè)大學(xué) 2018



本文編號(hào)：3088810