傳統(tǒng)免疫分析方法主要包括酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)和免疫層析法(Immunochromatographic assay,ICA)兩大類。其中,ELISA采用辣根過氧化物酶(Horse radish peroxidase,HRP)催化有機(jī)底物四甲基聯(lián)苯胺(Tetramethyl benzidine,TMB)顯色作為免疫分析的信號(hào)源,而ICA則采用30-40 nm球形膠體金納米粒子(Gold nanoparticle,AuNP)為信號(hào)源。以上兩大類方法因信號(hào)輸出能力弱,導(dǎo)致檢測(cè)方法靈敏度總體偏低,介于μg/mL-ng/mL之間,難以滿足微量乃至痕量目標(biāo)分析物檢測(cè)的需求。提高上述兩類免疫分析方法的檢測(cè)靈敏度對(duì)于拓寬其應(yīng)用范圍具有重要的學(xué)術(shù)以及實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。基于此,本研究構(gòu)建了兩種改善傳統(tǒng)免疫分析方法檢測(cè)靈敏度的新型信號(hào)放大策略,具體內(nèi)容如下:(1)提高信號(hào)分子的負(fù)載量構(gòu)建高信號(hào)輸出能力得探針是提高免疫分析方法檢測(cè)靈敏度常用的策略之一。其中以納米粒子為載體負(fù)載酶可以在單個(gè)納米粒子上實(shí)現(xiàn)大量酶分子的固定化,因而可顯著提高ELISA檢測(cè)信號(hào),實(shí)現(xiàn)待測(cè)物超靈敏檢測(cè)。本研究擬以多枝狀納米金(Gold nanoflower,AuNFs)為載體,通過在其表面修飾雙親性配體,利用AuNFs表面疏水腔分別大量負(fù)載四苯基卟啉鐵(FeTPPCl)及熒光素(Fluorescein)分子,以制備兩種高效的納米酶(AuNF@FeTPPCl和AuNF@Fluorescein)。利用FeTPPCl和Fluorescein的HRP模擬酶活性以及AuNFs的超強(qiáng)裝載能力,在傳統(tǒng)固相酶免疫學(xué)分析基礎(chǔ)上,分別構(gòu)建高靈敏檢測(cè)食品中伏馬毒素B_1(Fumonisin,FB_1)的直接競爭ELISA和血清中甲胎蛋白(Alpha fetoprotein,AFP)的雙抗體夾心ELISA。同時(shí),采用Fluorescein的熒光發(fā)射作為免疫學(xué)信號(hào)輸出,進(jìn)一步構(gòu)建“比色-熒光”雙模式ELISA新方法,大大提高傳統(tǒng)單模式分析的準(zhǔn)確性。為此,本研究首先合成了氨基/羧基末端的雙親性鏈“巰基-壬烷-四甘醇-氨基/羧基”并借助Au-S鍵的強(qiáng)配位作用將其修飾于90 nm AuNFs表面,形成疏水腔。隨后通過疏水相互作用分別將FeTPPCl和Fluorescein負(fù)載于AuNFs的表面疏水腔中,形成AuNF@FeTPPCl和AuNF@Fluorescein納米酶。酶載量分析顯示,單個(gè)AuNF載體可分別負(fù)載2.4×10~6個(gè)FeTPPCl和3.67×10~6個(gè)Fluorescein;酶活性分析表明,FeTPPCl和Fluorescein的裝載和釋放對(duì)其HRP模擬酶活性沒有明顯影響,且該納米酶對(duì)底物H_2O_2和TMB的單位轉(zhuǎn)化數(shù)(Kcat)較傳統(tǒng)HRP提高了1-2數(shù)量級(jí),有助于提高傳統(tǒng)ELISA的檢測(cè)靈敏度。此外,該納米酶還展現(xiàn)了更強(qiáng)的環(huán)境耐受性和長期保存穩(wěn)定性,大大改善了方法學(xué)的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。鑒于此,一方面以AuNF@FeTPPCl為載體偶聯(lián)牛血清白蛋白(Bovine serum albumen,BSA)和FB_1作為競爭抗原以構(gòu)建直接競爭ELISA實(shí)現(xiàn)FB_1定量檢測(cè),在最優(yōu)條件下,其線性方程為y=-15.59ln(x)+123.84,R~2=0.9954,半數(shù)抑制濃度(50%inhibitory concentration,IC_(50))為101 pg/mL,較常規(guī)ELISA低250倍,進(jìn)一步將該方法應(yīng)用于檢測(cè)FB_1加標(biāo)的大米、玉米和小麥樣品,其回收率為87.9-110.8%,變異系數(shù)小于20%,表明該方法具有較好的準(zhǔn)確度,可用于實(shí)際樣本中FB_1的檢測(cè);另一方面以AuNF@Fluorescein為載體,結(jié)合生物素-鏈霉親和素放大體系,建立了靈敏、準(zhǔn)確檢測(cè)甲胎蛋白(AFP)的“比色-熒光”雙模式夾心ELISA,在最優(yōu)條件下,采用比色檢測(cè)模式,其線性方程為y=2.0785x+109.8,檢測(cè)靈敏度為17.7 pg/mL,較常規(guī)ELISA高15倍,而采用熒光檢測(cè)模式,其線性方程為y=1.2924x+0.1117,檢測(cè)靈敏度低至29 fg/mL,較常規(guī)ELISA高9300倍,進(jìn)一步將該方法應(yīng)用于20個(gè)AFP加標(biāo)血清樣本的檢測(cè),并將其檢測(cè)結(jié)果與商業(yè)化Abcam化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行對(duì)比,表明該方法兩種檢測(cè)模式下與試劑盒的檢測(cè)結(jié)果均有較高的線性相關(guān)性(相關(guān)系數(shù):比色為R~2=0.9856,熒光為R~2=0.9966),同時(shí)與血清中其他常見蛋白標(biāo)志物無明顯交叉反應(yīng),表明該“比色-熒光”雙模式ELISA適用于實(shí)際血清樣本中AFP的靈敏、準(zhǔn)確檢測(cè)。(2)提高AuNP探針的信號(hào)強(qiáng)度是改善免疫層析方法靈敏度的重要策略。金、銀信號(hào)生長增強(qiáng)策略通過在AuNP表面還原沉積金、銀納米殼層,誘導(dǎo)AuNP粒徑增大,因而可大大提高試紙條靈敏度。但該方法納米殼層的還原沉積嚴(yán)格依賴時(shí)間變化的生長模式,有著嚴(yán)格的操作要求,重現(xiàn)性差,且常產(chǎn)生非特異性背景信號(hào)。針對(duì)以上問題,本研究建立了聚乙烯亞胺(polyethyleneimine,PEI)為骨架,銅納米粒子可控生長增強(qiáng)AuNP-ICA檢測(cè)靈敏度新方法。在該模式下,AuNP探針通過PEI介導(dǎo)飽和吸附銅離子,隨后通過抗壞血酸鈉還原為單質(zhì)銅沉積于AuNP探針表面,增大其粒徑,顯著增強(qiáng)AuNP顯色信號(hào)強(qiáng)度。由于被吸附的銅離子量與檢測(cè)線上捕獲的AuNP探針數(shù)量呈現(xiàn)良好的劑量關(guān)系,因此該方法具有檢測(cè)靈敏度高、重現(xiàn)性好的特點(diǎn)。在最適條件下,將銅納米粒子可控生長的AuNP-ICA用于檢測(cè)牛奶中的大腸桿菌O157:H7,其檢測(cè)靈敏度為6CFU/mL,較放大前提高了三個(gè)數(shù)量級(jí),且檢測(cè)時(shí)間少于20分鐘。進(jìn)一步利用該方法對(duì)17種常見的食源性致病菌進(jìn)行檢測(cè),未見明顯交叉反應(yīng),表明該方法具有良好的特異性。通過對(duì)15個(gè)隨機(jī)加標(biāo)的牛奶樣進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示回收率介于84%-116%之間,變異系數(shù)均小于12%,表明該方法能夠用于大腸桿菌O157:H7的現(xiàn)場(chǎng)快速超靈敏定量篩查。
【學(xué)位單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：TS207.4
【部分圖文】：

Figure 3. Schematic of the the catalase based fluorescence ELISA for OTA detection.圖 3 基于過氧化氫酶熒光 ELISA 檢測(cè) OTA 原理圖。1.2.4 適配新型信號(hào)輸出體系盡管制備高信號(hào)強(qiáng)度的納米探針提高免疫分析方法的檢測(cè)靈敏度展現(xiàn)了大的應(yīng)用前景，但是這些新興的技術(shù)往往無法與市場(chǎng)現(xiàn)有的技術(shù)平臺(tái)完全匹導(dǎo)致產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)化效率偏低。例如：針對(duì) HRP/堿性磷酸脂酶的保護(hù)劑不適用于基納米材料構(gòu)建的傳感器；納米材料的穩(wěn)定性依賴于其表面配體，無法凍干處等[72]。因此采用催化活性更高的酶取代 HRP 作為標(biāo)記物，并適配信號(hào)輸出能更強(qiáng)的底物作為信號(hào)源是提高傳統(tǒng)免疫分析方法靈敏度的有效策略。如圖 3示，Huang 等以過氧化氫酶作為標(biāo)記物，以過氧化氫敏感的量子點(diǎn)作為信號(hào)通過在過氧化氫酶上標(biāo)記抗原，建立直接競爭熒光 ELISA 超靈敏檢測(cè)糧食OTA 的新方法[4]。除了上述的熒光 ELISA 外，表面等離子共振 ELISA 也是過采用新型的等離子信號(hào)輸出體系提高免疫分析方法檢測(cè)靈敏度。早在 2

第 1 章 引言響應(yīng)型ELISA也是通過采用新型信號(hào)輸出體系提高免疫分析技術(shù)檢測(cè)靈敏度的策略之一[80]，其原理如圖 4 所示。以葡萄糖氧化酶/脲酶等能夠催化底物產(chǎn)酸或產(chǎn)堿的天然酶為標(biāo)記物，采用溴甲酚紫等 pH 敏感的指示劑作為信號(hào)源建立 pH響應(yīng)型 ELISA[81]。但是這類方法由于采用的 pH 指示劑過于敏感，且底物往往需要溶解在超純水等緩沖能力弱的緩沖液中，因而在實(shí)際應(yīng)用中操作難度較大，重現(xiàn)性低。

第 1 章 引言到 10-19M[91]。此外，由于金屬優(yōu)異的光學(xué)特性，因此金屬生長法也被開發(fā)應(yīng)用于信號(hào)增強(qiáng)，相較于上述增強(qiáng)策略，金屬生長法不需要對(duì)免疫學(xué)探針進(jìn)行額外的改造[92]。如圖 5 所示，在試紙條上完成第一輪免疫學(xué)反應(yīng)后，通過在試紙條檢測(cè)區(qū)域二次涌動(dòng)、滴加或者浸泡等方式添加金屬生長液，在還原劑的作用下，金屬離子被還原成單質(zhì)并通過“負(fù)電位沉積效應(yīng)”沉積在膠體金表面進(jìn)而提高探針的信號(hào)強(qiáng)度[93]。目前常見的金屬生長策略主要包括金和銀兩種貴金屬的生長[94-99]。盡管金屬生長法不需要設(shè)計(jì)和合成復(fù)雜的納米材料或者開發(fā)高敏的信號(hào)輸出體系，但是該類方法需要后期添加增強(qiáng)液，這無形延長了檢測(cè)時(shí)間，因此不適用于對(duì)檢測(cè)時(shí)間要求嚴(yán)格的目標(biāo)物分析。此外，相對(duì)于傳統(tǒng)信號(hào)輸出模式，信號(hào)放大策略在常規(guī)免疫分析技術(shù)流程之外需要額外增加信號(hào)放大流程，因此有著更大的系統(tǒng)誤差。
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本文編號(hào)：2841131