發(fā)布時(shí)間：2020-09-10 07:32

　　 核技術(shù)廣泛運(yùn)用在工業(yè)、科研和醫(yī)療等方面,在促進(jìn)社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的同時(shí)對(duì)人類(lèi)的健康也造成了危害。目前,大多數(shù)輻射防護(hù)劑具有一定的毒副作用,人類(lèi)不得不尋找既安全又能抗輻射的藥物。我們前期開(kāi)展了方格星蟲(chóng)多糖(Sipunculus nudus polysaccharide,SNP)抗輻射的動(dòng)物藥效學(xué)實(shí)驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn)SNP對(duì)電離輻射誘導(dǎo)的小鼠造血和免疫系統(tǒng)等損傷均具有保護(hù)作用。為探索SNP的防護(hù)作用機(jī)制,本實(shí)驗(yàn)在以往的基礎(chǔ)上,在體外細(xì)胞水平開(kāi)展了研究。具體研究?jī)?nèi)容和獲得的結(jié)果如下:1.SNP的提取與制備:從廣西北海購(gòu)買(mǎi)曬干的方格星蟲(chóng),切段、搗碎,以10%的NaOH堿解,用三氯乙酸脫蛋白,獲得粗多糖;用0.1 mg/mL的葡萄糖做標(biāo)準(zhǔn)溶液,于紫外分光光度計(jì)490nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,于相同波長(zhǎng)條件下測(cè)定1 mg/mL方格星蟲(chóng)粗多糖的吸光度值,經(jīng)計(jì)算SNP的多糖含量為60%。2.HUVEC和HIEC細(xì)胞輻射損傷模型的建立:選取正常人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和人腸上皮細(xì)胞作為~(137)Csγ射線電離輻射損傷效應(yīng)模型,HUVEC細(xì)胞給予0-10 Gy照射,HIEC細(xì)胞給予0-20 Gy照射,照射后采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率;2 Gy、4 Gy、6 Gy、8 Gy和10 Gy照射后,HUVEC細(xì)胞存活率顯著下降,分別為87.94%、84.69%、70.25%、65.74%和54.78%;經(jīng)2 Gy、4 Gy、6 Gy、8 Gy、10 Gy、15 Gy、20 Gy照射后,HIEC存活率分別為80.39%、76.23%、70.55%、70.82%、66.49%、54.66%和53.12%,與正常對(duì)照組相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05,p0.01);且細(xì)胞存活率均與輻照劑量呈負(fù)相關(guān)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道,分別選擇8 Gy和10 Gy作為HUVEC和HIEC細(xì)胞輻射損傷的造模劑量。3.SNP對(duì)HUVEC和HIEC輻射防護(hù)作用的研究:(1)SNP對(duì)細(xì)胞的毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與DMSO陽(yáng)性對(duì)照組相比,SNP在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)(HUVEC細(xì)胞SNP終濃度分別為0.5,1,5,10,50,100,200,500?g/mL,HIEC細(xì)胞SNP終濃度分別為1、10、50、100、200、500、1 000μg/mL),對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性作用;(2)分別以8 Gy和10 Gy ~(137)Csγ射線對(duì)HUVEC和HIEC細(xì)胞進(jìn)行一次性照射,研究不同濃度的SNP對(duì)受照細(xì)胞增殖的影響情況,結(jié)果顯示,一定濃度的SNP預(yù)處理能改善照射對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用;(3)采用Giemsa染色觀察細(xì)胞的克隆形成率,結(jié)果顯示,與輻照模型組相比,SNP預(yù)處理可有效改善照射后細(xì)胞的克隆形成能力;(4)采用Hoechst33342/PI雙染法結(jié)合顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡時(shí)發(fā)現(xiàn),HUVEC和HIEC細(xì)胞的模型組凋亡細(xì)胞均較正常對(duì)照組增多,SNP預(yù)處理后,凋亡細(xì)胞均較輻照模型組減少;采用Annexin V/PI染色流式細(xì)胞儀定量檢測(cè)細(xì)胞凋亡率時(shí)發(fā)現(xiàn),8 Gy照射HUVEC細(xì)胞后,其凋亡率顯著上升(由1.02%上升至15.6%),而SNP預(yù)處理組的輻照細(xì)胞凋亡率顯著下降至6.8%(P0.01),HIEC經(jīng)10 Gy照射后細(xì)胞凋亡率顯著上升(由2.12%上升至14.37%),而經(jīng)SNP預(yù)處理后的輻照細(xì)胞凋亡率顯著下降至7.18%(p0.01);(5)采用DCFH-DA探針?lè)ńY(jié)合流式細(xì)胞術(shù),檢測(cè)HUVEC和HIEC細(xì)胞各組樣品中ROS生成水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn),照射后HUVEC細(xì)胞中ROS mean值由32.63?10~4增加到47.10?10~4(p0.01),經(jīng)SNP預(yù)處理后,細(xì)胞內(nèi)ROS mean值降至41.77?10~4(p0.05);HIEC細(xì)胞經(jīng)照射后,其ROS mean值由4.76?10~4增加到16.69?10~4,(p0.01),SNP預(yù)處理后,細(xì)胞內(nèi)ROS mean值降至9.81?10~4(p0.01)。(6)采用試劑盒檢測(cè)HUVEC和HIEC細(xì)胞各組樣品中抗氧化酶(SOD、CAT、GST、GSH-Px)活性、脂質(zhì)過(guò)氧化物(MDA)和DNA氧化損傷產(chǎn)物—8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷(8-OHdG)含量,結(jié)果發(fā)現(xiàn),與正常對(duì)照組相比,輻照模型組SOD、CAT、GST、GSH-Px活性降低,MDA和8-OHdG含量升高,SNP預(yù)處理后細(xì)胞中SOD、CAT、GST、GSH-Px活性較輻照模型組增加,MDA和8-OHdG含量較之下降。4.SNP對(duì)HUVEC和HIEC輻射防護(hù)作用機(jī)理的研究:采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)HUVEC和HIEC細(xì)胞中DNA雙鏈斷裂的標(biāo)志物γ-H2AX進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)細(xì)胞照射后2、4、8 h,輻照模型組中γ-H2AX均升高,SNP預(yù)處理的細(xì)胞中γ-H2AX均較輻照模型組低(p0.05,p0.01);采用RT-PCR檢測(cè)hOGG1和RAD51基因表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn),輻照模型組中hOGG1和RAD51的mRNA表達(dá)均下調(diào),SNP預(yù)處理則顯著上調(diào)了hOGG1和RAD51的表達(dá)。綜上,SNP預(yù)處理可促進(jìn)受照細(xì)胞增殖和克隆形成,抑制細(xì)胞凋亡,能保護(hù)抗氧化酶活性,降低MDA和8-OHdG含量含量,減少DNA雙鏈斷裂,上調(diào)hOGG1和RAD51的表達(dá)。結(jié)果提示,SNP具有良好的抗輻射作用,其主要作用機(jī)制是通過(guò)清除自由基、減輕輻射對(duì)細(xì)胞DNA的氧化損傷、促進(jìn)DNA修復(fù)、減少細(xì)胞凋亡,發(fā)揮輻射保護(hù)作用。
【學(xué)位單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類(lèi)】：TS201.4
【部分圖文】：

繼原條件培養(yǎng) 48 小時(shí)。PBS 洗 3 次，在冰上消化收集細(xì)胞，用 Annexin V/P進(jìn)行染色，上流式定量檢測(cè)各細(xì)胞凋亡率，實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次。結(jié)果如圖 4-8 和 4所示，在經(jīng)過(guò) 8 Gy137Cs γ 線輻射后，對(duì)照組的凋亡率為 15.6%，而 SNP 預(yù)處理組的凋亡率為 6.8%，SNP 組凋亡率的顯著降低（P<0.01）。采用 Hoechst33342/PI 法結(jié)合顯微鏡觀察 SNP預(yù)處理對(duì)輻照后HIEC 細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果見(jiàn)圖 4-9。由圖 4-9 可知，輻照后 48 h HIEC 細(xì)胞藍(lán)色熒光增強(qiáng)，此外，一些細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)亮紅色，另外一些細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)暗紅色，說(shuō)明137Cs γ 射線照射至輻射劑量為 10 Gy 后的細(xì)胞有凋亡也有壞死，而經(jīng)過(guò) SNP 預(yù)處理后，細(xì)胞內(nèi)藍(lán)色熒光和紅色熒光均降低，提示 SNP 能有效改善輻照對(duì)細(xì)胞的損傷。為進(jìn)一步驗(yàn)證 SNP 的防護(hù)效應(yīng)，我們采用流式細(xì)胞儀定量檢測(cè)其凋亡率。于輻照后 48 h，冰上消化、離心收集細(xì)胞，進(jìn)行 Annexin V/PI 染色，上流式儀，見(jiàn)圖4-11，圖中右下象限代表細(xì)胞早期凋亡的比率，右上象限分別表示晚期凋亡的比率。由圖 4-12 可知，137Cs γ 線輻照后，細(xì)胞凋亡率顯著上升（由 2.12% 上升至14.37%），并且以早期凋亡細(xì)胞為主，而經(jīng) SNP 預(yù)處理后的輻照細(xì)胞凋亡率顯著下降，僅為 7.18%，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.01），見(jiàn)圖 4-12。0Gy SNP(-)8Gy SNP(-)0Gy SNP(+)8Gy SNP(+)

圖 4-8 流式細(xì)胞檢測(cè)圖Fig.4-8 Cell apoptosis analysis by flow cytometry圖 4-9 SNP 對(duì) HUVEC 細(xì)胞凋亡的影響(** p<0.01,與 0 Gy0 μg/mL SNP 組相比；## p<0.01 與 8 Gy 0 μg/mLSNP 組相比.)Fig.4-9 Effects of SNP on apoptosis of HUVEC cells051015200 8Apoptosisrate(%)Irradiation dose (Gy)SNP（-）SNP（+）**##

圖 4-10 SNP 對(duì)輻照后 HIEC 細(xì)胞凋亡的影響圖 4-10 SNP 對(duì)輻 HIEC 細(xì)胞凋亡的影響(Hoechst33342/PI 法)Fig.4-10 Effect of SNP on apoptosis of HIEC cells after irradiation (Hoechst33342/PImethod)0Gy 10GySNP(-)PI-A

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2815550