β-伴大豆球蛋白是大豆中重要的貯藏蛋白,同時也是大豆主要過敏原之一,會引發(fā)食物過敏危害人體健康。目前食物過敏在臨床上尚未有有效的預(yù)防及根除方法,唯一安全有效的措施是避免食用及接觸過敏原。對于大豆?jié)撛谶^敏患者和大豆及其副產(chǎn)品加工企業(yè),建立β-伴大豆球蛋白的定量檢測方法顯得尤為重要。由于表面增強拉曼散射技術(shù)具有高靈敏度、高親和力、指紋式的分辨能力,并能使信號強度增強6~10個數(shù)量級等優(yōu)點。因此,本論文基于β-伴大豆球蛋白抗體的制備,組裝β-伴大豆球蛋白快速檢測的雙抗體夾心方法,并嘗試建立新型以膠體金為活性基底的拉曼增強免疫試紙檢測方法,為過敏消費者食物中過敏原的檢測提供方便快捷的檢測工具。本課題的主要研究內(nèi)容如下:1.通過等電點沉淀法分離提取,硫酸銨沉淀法純化制備β-伴大豆球蛋白。將β-伴大豆球蛋白按照免疫程序免疫BALB/c小鼠,經(jīng)間接ELISA法鑒定獲得效價高達(dá)1:12800的多克隆抗體,其敏感性IC_(50)值達(dá)到718 ng/mL,與芝麻蛋白、麥胚球蛋白交叉反應(yīng)率小于0.2%,與花生蛋白交叉反應(yīng)率為5.6%,與大豆球蛋白交叉反應(yīng)率為8%。2.通過細(xì)胞融合技術(shù)將高效價及強敏感性的小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合為雜交瘤細(xì)胞,通過篩選及亞克隆獲得產(chǎn)特異性抗體的細(xì)胞株3C9和3D11,經(jīng)體內(nèi)誘生法大量制備單克隆抗體,得到兩株單抗3D11 mAb、3C9 mAb。兩株單克隆抗體亞型鑒定均為重鏈IgG1型,輕鏈Kappa型,且特異性良好,均與α’亞基反應(yīng)最強烈;間接ELISA測定3D11 mAb效價達(dá)到1:1.28×10~5,其半數(shù)抑制濃度IC_(50)值為911 ng/mL,親和力常數(shù)為9.6×10~9 L/moL;間接ELISA法測定3C9 mAb效價達(dá)到1:2.56×10~5,其IC_(50)值為2.91μg/mL,親和力常數(shù)為1.42×10~(11) L/moL。并利用正辛酸-硫酸銨沉淀法純化抗體,純化后單克隆抗體純度提高到72%。3.建立以β-伴大豆球蛋白的兔源多克隆抗體作為檢測抗體和以3D11 mAb作為固定化捕捉抗體的雙抗體夾心免疫層析試紙方法。經(jīng)4-氨基苯硫酚修飾膠體金并結(jié)合抗體制備成拉曼免疫探針,建立表面增強拉曼側(cè)向免疫層析試紙的快速檢測方法。SERS-LFA法在160 ng/mL~100μg/mL范圍可對樣品中β-伴大豆球蛋白含量的進行檢測,其滿足y=65.1360x+113.9210,R~2=0.9636,檢測限為32 ng/mL。
【學(xué)位單位】：河南工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：TS214
【部分圖文】：

Western blot 鑒定白凝膠電泳后，在 200 mA 的電流、80 V 的電壓下，將 PVDF 膜封閉 1 h，洗膜，與鼠多抗血清反應(yīng)孵育 1 h，洗膜后平整放入暗匣準(zhǔn)備顯色。將 EC取出膠片壓到膜上，壓片時間視發(fā)光強弱選擇，經(jīng)DS-PAGE 鑒定白的 SDS-PAGE 電泳鑒定結(jié)果如圖 1，β-伴大豆球 Gel-Pro analyzer 軟件分析，α’，α 和 β 分子量分別量分別約為 29.0%、25.7%、16.2%，β-伴大豆球M 1

河南工業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文價是指在任何篩選實驗中均能和抗原出現(xiàn)明顯的、可檢測到的反應(yīng)倒數(shù)[77]。每次免疫后第十天檢測效價，五次免疫的平均變化趨勢如映出數(shù)只小鼠平均血清最大稀釋度在不斷上升，60 μg 的免疫量小鼠升更快，但實際上在五免時就有小鼠效價達(dá)到 1:12800，在六免時維免結(jié)果如表 6，根據(jù) OD檢測孔/OD陰性孔≥2.1 為陽性，可得：一二組小在 1:6400 及以上，選用高效價的小鼠進行加強免疫以用于后續(xù)單克

抗體均能產(chǎn)生抑制，且血清抑制率與競爭蛋白濃度呈對數(shù)關(guān)系。其中敏感性最好，圖 3 為 6 號鼠源多克隆抗體間接競爭 ELISA 抑制曲線回歸方程可以求出在線性范圍 75～4800 ng/mL 時，該鼠源多克隆抗白的半數(shù)抑制率 IC50為 718 ng/mL，相關(guān)系數(shù) R2=0.9802。表 7 間接競爭法測定小鼠多抗血清抑制效價競爭蛋白濃度（ng/mL）空白半00 2400 1200 600 300 150 75 010 0.285 0.419 0.546 0.673 0.709 0.796 0.834 0.052 67 0.232 0.347 0.430 0.493 0.592 0.683 0.787 0.048 00 0.352 0.383 0.537 0.640 0.651 0.678 0.760 0.050 79 0.234 0.338 0.435 0.509 0.570 0.630 0.665 0.049 57 0.223 0.264 0.333 0.418 0.370 0.526 0.547 0.050 28 0.144 0.210 0.295 0.335 0.386 0.470 0.532 0.048

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本文編號：2814719