孔雀石綠(MG)因具有較強的殺蟲、抗菌和防止感染等效果,被非法用于水產養(yǎng)殖中,但由于MG進入人體后具有致畸、致癌和致突變等危害。因此,開展快速、準確的MG殘留檢測方法十分重要。本文基于核酸適配體的特異識別能力,建立了MG的可視化檢測方法,并成功地應用于魚肉和養(yǎng)殖水樣中MG的快速檢測。論文主要內容如下:第一部分,基于納米金(AuNPs)和RNA適配體可視化檢測MG。利用鹽(NaCl)導致AuNPs團聚,溶液顏色由紅色變成藍色,而MG-RNA適配體可通過靜電吸附保護AuNPs,使其在鹽溶液中不發(fā)生聚集而呈紅色。但當體系中有MG存在時,RNA適配體從AuNPs表面脫離并與MG特異性結合,使游離的AuNPs遇鹽而發(fā)生聚集呈藍色。隨著MG濃度的增大,溶液于520 nm處的吸光度值逐漸降低,而690 nm處的吸光度值逐漸升高,即溶液顏色由紅色逐漸變?yōu)樗{色。因此,可通過肉眼觀察溶液顏色變化或通過吸光度值來確定MG含量,整個檢測過程不超過1小時。當NaCl濃度為0.2 mol L~(-1)、RNA濃度為10μmol L~(-1)及AuNPs的濃度為7 nmol L~(-1)時,MG的檢測線性范圍為0.6~12.5μmol L~(-1)(線性方程為Δ(A_(690)/A_(520))=0.06C-0.01,R~2為0.993),檢出限0.04μmol L~(-1)(3α/κ,n=9)。將此方法應用于養(yǎng)殖水樣中MG的檢測,加標回收率為92%~108%,說明方法對MG殘留的檢測具有巨大潛力。第二部分,基于DNA適配體抑制Fe_3O_4NPs模擬酶催化活性的MG可視化檢測方法。Fe_3O_4納米粒子(Fe_3O_4NPs)具有很強的催化活性,能夠催化H_2O_2氧化3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺(TMB),使溶液由無色變?yōu)樗{色。然而,Fe_3O_4NPs的催化活性可被MG-DNA適配體抑制,使溶液藍色變淺。當MG存在時,DNA適配體與MG特異性結合,此時Fe_3O_4NPs的催化活性恢復。因此,根據溶液顏色的變化或650 nm處吸光度值的變化即可確定MG的含量。基于該可視化檢測法,MG的檢測范圍為0.1~1μmol L~(-1),檢出限為9.5 nmol L~(-1)(3σ/k,n=9)。將此方法用于養(yǎng)殖水及魚肉中MG的檢測,加標回收率為80%~120%,RSD小于6.4%。方法快速、靈敏、特異性強。第三部分,基于CTAB抑制AuNPs過氧化物模擬酶活性的MG可視化檢測方法。AuNPs具有較強的過氧化物酶活性,可催化TMB與H_2O_2的氧化反應,使溶液顏色變藍。但是十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)可導致AuNPs聚集而抑制其催化活性。當加入MG-RNA適配體后,帶負電荷的RNA適配體可與CTAB陽離子結合,使AuNPs催化活性恢復。然而,當檢測體系存在MG時,MG與RNA適配體特異性結合,釋放的CTAB可導致AuNPs團聚使溶液顏色變淺。因此,通過溶液顏色的變化或650 nm處吸光度值的變化,可確定濃度范圍為0.01~2μmol L~(-1)的MG含量,檢出限為1.8 nmol L~(-1)。將此方法用于養(yǎng)殖水樣中MG的檢測,加標回收率為80~120%,與HPLC及ELISA的檢測結果一致,說明方法適應性強。
【學位單位】：集美大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：TS254.7
【部分圖文】：

圖 1-1 SELEX 篩選技術原理圖[24]Fig. 1-1. General scheme of the SELEX procedure[24]酸適配體在小分子快速檢測中的應用來，食品質量安全問題日益凸顯，危害食品質量安全的小分子有害物質配體是一種單鏈寡核苷酸結合分子，這些功能性 DNA 或 RNA 結構可和力和特異性的靶點，因此，基于核酸適配體的檢測法常被用于小分見的基于核酸適配體快速檢測食品中小分子的方法有以下幾種：） 比色/熒光法核酸適配體快速檢測小分子的比色和熒光法常用到納米金（AuNPs）單、穩(wěn)定性強、具有獨特的光電性質，以及可以通過改變大小形狀和性質等特點，被廣泛應用于構建生物、化學傳感領域中[34, 35]。定條件下，AuNPs 會發(fā)生聚集誘導粒子間表面等離子體偶聯(lián)，肉眼可[36][

以實現(xiàn)對 ATP 的簡單、快速檢測，檢出限鏈反應和 AuNPs 可視化檢測甲基化 DNA 的變化，可檢測到 0.01 fmol L-1的甲基化 DN分子識別中起到關鍵作用，基于核酸適配體[75-77]由 38 個堿基組成，如圖 2-1 所示，其結構，以及由 10 個堿基和 6 個堿基組成的ACUGGCGAGAGCCAGGUAACGAAUGGA 適配體可以剪裁成 27 個堿基序列，與 3 研 究 使 用 27 個 堿 基 序 列 的 MG-RAGGUAACGAAUGGA-3’。和 RNA 適配體建立了可視化檢測 MG 的方受鹽誘導的聚集作用，使 AuNPs 呈分散狀 MG 特異結合，導致 AuNPs 失去保護而聚可見光度法可檢測出溶液在 520 nm 和 690度高、選擇性強，可用于水產養(yǎng)殖水樣中微

學位論文 基于核酸適配體可視化檢測水產品中孔雀石綠12圖2-2 基于核酸適配體和無標記AuNPs可視化檢測MG的原理圖Fig. 2-2. Schematic illustration of the colorimetric assay for MG based on the specific aptamer andunmodified AuNPs圖 2-2 為基于 RNA 適配體和 AuNPs 可視化檢測 MG 的原理圖。為了證實實驗原理，對 AuNPs 在不同條件下的狀態(tài)進行了 TEM 表征，結果如圖 2-3 所示。圖 2-3 (A) 結果表明，制得的 AuNPs 粒徑約為 13 nm，分散性良好，這可能是由于檸檬酸鹽負電荷的穩(wěn)定作用[82]。在 AuNPs 溶液中加入 NaCl 時，由于鹽可以屏蔽帶負電粒子的靜電穩(wěn)定作用[83]，AuNPs 會發(fā)生聚集，如圖 2-3 (D) TEM 圖證實了 NaCl 存在時 AuNPs 為聚集狀態(tài)。在該溶液中加入 MG-RNA 適配體后

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本文編號：2811250