魚鰾作為水產(chǎn)品加工副產(chǎn)物之一,富含膠原蛋白、多肽和黏多糖等活性物質(zhì),是藥食兩用的滋補珍品,中醫(yī)認為其具有補腎益精、散瘀消腫等功效,但其作用效果和功效因子不明。本課題以魚鰾為原料提取類肝素化合物,并對其進行分離純化、結構鑒定以及體外抗凝血和抗炎活性評價,以期為進一步闡明魚鰾糖胺聚糖的結構組成和構效關系提供參考,為魚鰾功效因子的開發(fā)與利用奠定基礎。主要研究內(nèi)容及結果如下:(1)建立并優(yōu)化魚鰾類肝素的提取工藝:采用酶法提取類肝素,并在單因素試驗基礎上,以加酶量、酶解時間和溫度為影響因子,以類肝素得率為響應值,采用響應曲面法進行優(yōu)化。結果表明,最佳提取條件為:2709堿性蛋白酶添加量5.4 mg/mL,酶解溫度50℃,時間20 h,在該條件下類肝素得率為(1.79±0.05)%,與預測值相差3.24%。(2)魚鰾類肝素的分離純化與理化性質(zhì)分析:采用大孔陰離子交換樹脂吸附、氯化鈉溶液梯度洗脫和乙醇沉淀進行分離純化,并以氯化鈉濃度、pH、溫度為影響因子,吸附率為響應值,采用響應曲面法優(yōu)化靜態(tài)吸附工藝。結果表明,最佳吸附條件為:氯化鈉濃度6.0 mg/mL,pH 8.0,溫度45℃;梯度洗脫分離出四個組分,F1、F2、F3和F4,其中F4的得率最高,為(2.22±0.02)%。理化性質(zhì)分析結果顯示從F1到F4,類肝素、糖醛酸、氨基己糖和硫酸基含量逐漸升高,蛋白質(zhì)含量遞減;醋酸纖維素薄膜電泳結果顯示,F1為單一條帶,遷移率最低;F2和F3有四個條帶;F4為單一條帶,遷移率最大。選取得率最高且理化性質(zhì)與肝素最接近的組分F4進行結構鑒定。(3)魚鰾類肝素的結構鑒定:通過紫外光譜、高效凝膠色譜、柱前衍生-高效液相色譜、傅里葉紅外光譜、酶裂解-質(zhì)譜/質(zhì)譜和核磁共振鑒定F4一級結構。結果表明:F4類肝素含量為(85.79±0.63)%;重均分子質(zhì)量約為115844±1401 u;單糖組成為葡萄糖醛酸、N-乙酰基半乳糖胺和少量的艾杜糖醛酸、半乳糖;且具有羧基、乙酰氨基、硫酸基軸向伸縮等特征吸收峰。最終確定魚鰾類肝素主要組成是由重復的二糖單位[→4GlcUAβ1→3Gal NAc(4S)β1→]構成的硫酸軟骨素A。(4)不同分子量魚鰾類肝素抗凝血與抗炎活性評價:為探討分子量對其抗凝血和抗炎活性的影響,首先采用透明質(zhì)酸酶對F4進行降解得到兩個低分子量類肝素組分:DP1和DP2,其重均分子量分別為6089±33 u和4963±37 u;再通過測定活化部分凝血活酶時間、凝血酶原時間和血漿凝血酶時間評價不同分子量的魚鰾類肝素體外抗凝血活性;采用LPS誘導的小鼠巨噬細胞RAW264.7炎癥模型評價其體外抗炎活性。結果表明,與肝素鈉相比,魚鰾類肝素的抗凝血作用較緩和,且分子量越低抗凝血活性越弱;各組分均能抑制LPS誘導的RAW264.7細胞炎癥模型中NO的過量分泌和ROS水平升高并存在劑量依賴性,且分子量越低效果越顯著。進一步分析表明,低分子量的魚鰾類肝素是通過抑制炎癥細胞分泌NO、ROS、IL-6、IL-1β和IL-10等炎癥介質(zhì)來緩解LPS誘導RAW264.7細胞發(fā)生的炎癥反應。
【學位單位】：廣東海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：TS254.9
【部分圖文】：

廣東海洋大學碩士學位論文rosoft Excel 2003 和 Origin 8.5 軟件作圖。分析類的篩選生物體內(nèi)一般以糖蛋白的形式存在，酶解可以將魚鰾中的分子多肽和氨基酸，使類肝素從糖蛋白中釋放出來。糖醛，其含量可以反映類肝素的含量；蛋白質(zhì)是魚鰾主要成分雜質(zhì)之一。因此，糖醛酸和類肝素得率越高、蛋白質(zhì)得率 種魚鰾的糖醛酸、類肝素和蛋白質(zhì)的得率見圖 2-1，可以物的糖醛酸和類肝素得率明顯比其它 3 種魚鰾高；而蛋白另外，類肝素化合物應是白色固體，本試驗所制備的鳙魚他魚鰾的提取物呈不同程度的暗黃色。故本研究后續(xù)實驗肝素。

圖 2-2 蛋白酶種類對魚鰾類肝素得率的影響fect of protease species on the extraction yield of hepariniods from試驗結果對魚鰾類肝素得率的影響圖 2-3 氯化鈉濃度對魚鰾類肝素得率的影響

10圖 2-3 氯化鈉濃度對魚鰾類肝素得率的影響fect of sodium chloride concentration on the extraction yield of heswim bladder工業(yè)生產(chǎn)中，常在酶解液中添加氯化鈉。但各文獻報道的差異。因此，有必要探究酶解時氯化鈉的添加量。如圖 提高魚鰾類肝素的得率。這可能是低濃度的中性鹽可以提提高酶解效率，促進多糖從糖蛋白中分離。另外，類肝素較高，鈉離子可以與帶負電荷的類肝素結合，促進更多類量分別為 0.1、0.2、0.3、0.4 mol/L 時，所得類肝素得率顯著（P<0.05）。因此，本研究選取氯化鈉的添加量為對魚鰾類肝素得率的影響

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