副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)是水產(chǎn)品中普遍存在的致病菌,在食品加工設(shè)施及水產(chǎn)品表面容易形成生物被膜(Biofilm,BF),生物被膜是細(xì)菌分泌多糖、蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)和eDNA,統(tǒng)稱胞外聚合物(Extracellular Polymeric Substances,EPS),包裹在其中的微生物群落,EPS是維持BF結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的重要基礎(chǔ),BF結(jié)構(gòu)是引起抗生素耐藥性以及消毒劑抗性增強(qiáng)的重要原因。本文首先建立了結(jié)構(gòu)分析方法,并對(duì)食品與臨床分離的副溶血性弧菌BF結(jié)構(gòu)作了普查研究,進(jìn)一步了解副溶血性弧菌的BF結(jié)構(gòu)差異性,本文主要是以副溶血性弧菌S36(VPS-36)為研究對(duì)象,探究了VPS-36 BF生長過程中結(jié)構(gòu)和化學(xué)物質(zhì)的相關(guān)性,結(jié)果顯示eDNA與VPS-36 BF結(jié)構(gòu)相關(guān)性最大,然后進(jìn)一步探究了eDNA在VPS-36 BF結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性中的作用。本文各章節(jié)研究內(nèi)容及對(duì)應(yīng)的結(jié)果如下:1.結(jié)構(gòu)分析方法的建立及副溶血性弧菌生物被膜結(jié)構(gòu)的普查副溶血性弧菌是水產(chǎn)品中常見的食源性致病菌,生物被膜的形成對(duì)副溶血性弧菌的環(huán)境生存和傳播至關(guān)重要。目前對(duì)不同來源的副溶血性弧菌生物被膜的比較基于結(jié)晶紫測定,不能比較結(jié)構(gòu)性的差異性。本文使用高吞吐量共聚焦激光掃描顯微鏡(Confocal laser scanning microscopy,CLSM)成像方法結(jié)合結(jié)構(gòu)分析軟件ISA-2,建立了一種結(jié)構(gòu)分析方法,分析22株食品與22株臨床來源菌株形成的BF結(jié)構(gòu)參數(shù)(生物體積,平均厚度,粗糙系數(shù))的差異性,結(jié)果顯示臨床菌株BF的變異系數(shù)比環(huán)境菌株BF的變異系數(shù)小,且同時(shí)攜帶tdh和trh兩種毒力因子的菌株BF變異性最小。凝聚層次聚類分析(AHC)結(jié)果顯示副溶血性弧菌BF可以分為致密且表面光滑(39%),斑駁且表面粗糙(27%),疏松且表面坑洼(34%),臨床菌株形成易形成致密且表面光滑和斑駁且表面粗糙的生物被膜,而環(huán)境菌株易形成斑駁且表面粗糙和疏松且表面坑洼的生物被膜。該研究提供了對(duì)副溶血性弧菌生物被膜結(jié)構(gòu)的深入理解。2.副溶血性弧菌生物被膜發(fā)育過程中結(jié)構(gòu)和化學(xué)物質(zhì)之間的相關(guān)性BF的復(fù)雜三維結(jié)構(gòu)由EPS支撐,并且EPS和生物被膜結(jié)構(gòu)發(fā)展中的化學(xué)變化的相關(guān)性分析提供控制BF的策略。使用共聚焦激光掃描顯微鏡和拉曼光譜(Raman spectroscopy,RS)研究副溶血性弧菌VPS36生物被膜的生長。通過CLSM表征生物被膜的結(jié)構(gòu)參數(shù)(生物體積,平均厚度和區(qū)域孔率),結(jié)果表明VPS-36 BF在孵育48 h后形成致密的3D結(jié)構(gòu)。RS結(jié)果顯示EPS中的碳水化合物和核酸含量協(xié)同變化。Pearson分析顯示EPS中化學(xué)成分的強(qiáng)度與生物體積和平均厚度呈正相關(guān),與區(qū)域孔率呈負(fù)相關(guān)。碳水化合物的強(qiáng)度與平均厚度顯著性相關(guān)(p-value0.01),核酸的拉曼強(qiáng)度與區(qū)域孔率顯著性相關(guān)(p-value0.01)。3.eDNA在副溶血性弧菌生物被膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性中作用的研究eDNA作為支架提供EPS的結(jié)構(gòu)完整性,隨后決定BF的三維結(jié)構(gòu),BF結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性是引起食品加工表面難以清除的重要原因。本研究評(píng)估了eDNA在VPS-36 BF結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性中的作用,利用DNase I酶靶向處理,AEW非靶向處理BF的eDNA。使用CLSM觀察副溶血性弧菌BF的三維活/死細(xì)胞成像,相對(duì)于對(duì)照組,結(jié)果顯示DNase I酶處理的BF活細(xì)胞含量減少(p=0.012),死細(xì)胞含量增多(p=0.017),而AEW處理的BF活細(xì)胞含量減少(p=0.011),死細(xì)胞含量沒有顯著性差異(p=0.980),我們猜測AEW處理之后導(dǎo)致BF結(jié)構(gòu)的崩解,活細(xì)胞和死細(xì)胞均從被膜結(jié)構(gòu)中逃逸。透射電鏡(TEM)觀察DNase I酶和AEW對(duì)BF結(jié)構(gòu)有破壞作用,eDNA定量結(jié)果顯示存在顯著性差異(p=0.002,p=0.001)。RT-QPCR結(jié)果顯示DNase I酶和AEW對(duì)副溶血性弧菌BF形成的群體感應(yīng)基因aphA,毒力表達(dá)基因opaR以及莢膜多糖cpsA,cpsQ,cpsR基因均有顯著性破壞作用(p0.01)。因此,AEW是一種有效的,環(huán)保,安全和廉價(jià)的消毒殺菌劑,可以通過破壞eDNA從而消除BF。
【學(xué)位單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：TS254.1
【部分圖文】：

圖 1-1 生物被膜形成過程[7]。Figure 1-1 Biofilm formation process[7].3 影響生物被膜形成的因素在 BF 形成過程中，底物和細(xì)胞表面的性質(zhì)，周圍環(huán)境因素和細(xì)菌遺傳調(diào)控在可逆或不可逆附著中起重要作用[6]。3.1 載體材料的物理性質(zhì)食品加工業(yè)中表面的物理特性對(duì)于 BF 形成非常重要，因?yàn)樗鼈冇绊懠?xì)菌初始附著。一般載體材料的表面張力、粗糙度以及疏水性會(huì)對(duì)細(xì)菌粘附和 BF 的形成造成一定的影響[11]。相對(duì)于疏水性材料表面（PPR、PPC、玻璃），細(xì)菌更傾向與粘附在親水表面（不銹鋼）。PPR、PPC、玻璃和不銹鋼等是食品加工設(shè)備常用的接觸材料，李燕杰等人[12]研究了這幾種常見食品加工材料對(duì)單增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)BF 形成的影響，結(jié)果表明四種材料表面均可以形成穩(wěn)定的 BF，材料粗糙度對(duì)形成 BF 有顯著影響，且粗糙度越大，越易形成 BF。抑制

技術(shù)路線圖

Table 2-3. Coefficient variation of biofilms formed by 44 Vibrio parahaemolyticus strains.Biofilm Parameters BV(×105μm3)AT(μm)BRClinical strains 13.39±4.81 12.05±4.03 0.64±0.24CV 36.46% 33.41% 36.69%Environmental strains 13.44±6.00 11.67±4.83 0.71±0.30CV 44.65% 41.35% 42.92%tdh+/trh+13.63±4.34 11.58±3.78 0.70±0.25CV 31.86% 32.65% 35.27%tdh+/trh-12.44±5.07 4.95±1.08 1.07±0.05CV 40.77% 33.98% 35.56%tdh-/trh+15.72±5.94 5.72±0.78 1.05±0.05CV 37.79% 40.92% 51.27%tdh-/trh-12.66±5.40 5.01±1.08 1.04±0.04CV 42.63% 39.03% 40.26%

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