【摘要】：隨著近年來(lái)常見(jiàn)水果品種的普及,人們?cè)絹?lái)越喜愛(ài)如桑葚、樹(shù)莓、車(chē)?yán)遄拥鹊谌�。由于三代水果口感�?營(yíng)養(yǎng)豐盛,富含具備保健功能的營(yíng)養(yǎng)因子,所以,無(wú)論鮮食還是用于食品或保健品的開(kāi)發(fā),價(jià)格都相當(dāng)昂貴。因此,其產(chǎn)品常會(huì)出現(xiàn)以假亂真、以次充好的現(xiàn)象,如某些桑葚加工品中不含桑葚,用廉價(jià)水果加香精來(lái)達(dá)到以假亂真的效果,這不單單欺騙了消費(fèi)者,也極大地?cái)_亂了市場(chǎng)秩序。運(yùn)用現(xiàn)代生物信息學(xué)的方法和數(shù)字PCR技術(shù),可建立快速、準(zhǔn)確的定性、定量檢測(cè)方法,為保證食品質(zhì)量和維護(hù)消費(fèi)者利益提供監(jiān)察技術(shù)手段。本試驗(yàn)通過(guò)運(yùn)用生物信息學(xué)的方法,利用perl語(yǔ)言程序下載多種常見(jiàn)水果基因組,并通過(guò)BLAST序列比對(duì)篩選出桑葚的特異性基因,從篩選的29262條序列經(jīng)分析篩選出目標(biāo)序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì),同時(shí)根據(jù)桑葚的這段序列設(shè)計(jì)出實(shí)時(shí)熒光PCR和數(shù)字PCR的引物、探針,通過(guò)對(duì)引物和探針的特異性、引物濃度和最適反應(yīng)退火溫度進(jìn)行了篩選和優(yōu)化,建立物種特異性定性、定量檢測(cè)方法,并對(duì)方法的靈敏度、檢出限和加工品的適用性進(jìn)行測(cè)試。(1)桑葚物種特異性常規(guī)PCR鑒定方法的建立:通過(guò)對(duì)桑葚物種特異性驗(yàn)證,PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序條件的優(yōu)化,以及方法靈敏度的確定,試驗(yàn)結(jié)果表明,本研究建立的方法物種特異性好,最適宜的退火溫度為56℃,引物濃度為0.6μmol/L,在優(yōu)化后的擴(kuò)增條件下能夠檢測(cè)出質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%的樣品(DNA,25 ng/μL),且重復(fù)性高。本方法對(duì)桑葚純果汁、桑葚?fù)匠戎旌瞎�、桑葚�(fù)教抑吞O(píng)果汁混合果汁、桑葚?fù)教抑约袄嬷旌瞎瓨悠贩謩e進(jìn)行了檢測(cè),樣品中的桑葚成分均能檢出。(2)桑葚物種特異性實(shí)時(shí)熒光定量PCR鑒定方法的建立:通過(guò)桑葚物種qPCR反應(yīng)體系的優(yōu)化,特異性和靈敏度檢測(cè),依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)DNA溶液擴(kuò)增曲線(xiàn)繪制了桑葚物種特異性基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),完成了對(duì)桑葚原性成分定量的檢測(cè)。結(jié)果顯示,本法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高的特點(diǎn),定量檢出限0.006 ng/μL的桑葚基因組DNA,桑葚DNA擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的方程為:y=3.529x+127.18,R2=0.995,擴(kuò)增效率E%為92.032%,可以用于定量檢測(cè)桑葚加工品。本方法可檢測(cè)桑葚成分含0.01%的桑葚純果汁以及可鑒定含有桑葚的混合果汁。(3)桑葚物種特異性數(shù)字PCR鑒定方法的建立:在實(shí)時(shí)熒光PCR試驗(yàn)篩選的引物和探針基礎(chǔ)上,通過(guò)特異性試驗(yàn)、引物和探針濃度的優(yōu)化、退火溫度的優(yōu)化以及定量線(xiàn)性范圍和LOQ驗(yàn)證,確定了最佳引物和探針濃度均別為0.4μmol/L,最適宜的退火溫度是57.9℃,定量檢出限可達(dá)到0.006 ng/μL的桑葚基因組DNA,根據(jù)數(shù)字PCR曲線(xiàn)方程可計(jì)算出樣品濃度,用于桑葚加工品的定量檢測(cè)。綜上所述,本研究基于生物信息學(xué)方法,結(jié)合定性PCR、實(shí)時(shí)熒光PCR、數(shù)字PCR技術(shù)建立了桑葚物種特異性分子生物學(xué)鑒定方法。該方法適用于各種桑葚果汁及加工品的摻偽鑒定,可為食品中桑葚源性成分定性、定量檢測(cè)提供了技術(shù)支撐。
【學(xué)位授予單位】：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：TS255.44;O657.3
【圖文】：

河北農(nóng)業(yè)大學(xué)全日制碩士專(zhuān)業(yè)學(xué)位（畢業(yè)）論文）高等植物內(nèi)源 PCR 擴(kuò)增結(jié)果以 TRNALue 植物內(nèi)源對(duì) 21 種水果 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物跑膠驗(yàn)證。結(jié)果（如圖 空白對(duì)照沒(méi)有擴(kuò)增出條帶，且引物二聚體少，說(shuō)明體系良好未受到污染；、車(chē)?yán)遄印⑿�、李子、梨、網(wǎng)紋甜瓜、牛油果、榴蓮、西瓜、西柚、柑橘、果、草莓、蔓越莓、桃、火龍果、龍眼、鳳梨和獼猴桃這 21 種水果均擴(kuò)增帶，條帶大小為 180 bp,說(shuō)明所提取水果基因組為植物基因組，可用于后續(xù)

表示樣品中存在一些雜質(zhì)，如碳水化合物、鹽（胍鹽）等，表4和表5可看出OD230/OD260的比值基本在 2.0 左右，說(shuō)明提取 DNA 較為純凈，且其他雜質(zhì)污染較少。由表 9 和表 10 可知，以上桑葚混合果汁的 DNA 濃度都在 25 ng/μL 以上。表 9和表 10 中混合果汁樣品除 S13、S16、S21 這三個(gè)樣品外 OD260/OD280的比值基本在1.8~2.0 之間；OD230/OD260的比值基本在 2.0 左右，說(shuō)明提取 DNA 較為純凈，且其他雜質(zhì)污染較少2.2.2 桑葚定性 PCR 結(jié)果分析2.2.2.1 引物篩選結(jié)果將設(shè)計(jì)好的 25 對(duì)引物分別與桑葚模板和水果混樣模板進(jìn)行 PCR，如圖 2，結(jié)果顯示(如圖 2)，桑葚引物 sangshen_02、sangshen_03、sangshen_04、sangshen_05、sangshen_06、sangshen_07、sangshen_08、sangshen_09、sangshen_15、sangshen_23、sangshen_24、sangshen_25 這 12 對(duì)引物擴(kuò)增條帶清晰，且沒(méi)有非特異性擴(kuò)增，因此最終將這 12 對(duì)引物的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析。

桑葚及其產(chǎn)品數(shù)字 PCR 鑒定方法的建立及研究sangshen_07、sangshen_08、sangshen_09、sangshen_15、sangshen_23、sangshen_24這 8 對(duì)引物與原始序列在 DNAMAN 中進(jìn)行序列比對(duì)。然后篩選出與原始序列差異最小的序列進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)驗(yàn)證。結(jié)果顯示（如圖 3），sangshen_05、sangshen_07、sangshen_08、sangshen_09、sangshen_15、sangshen_23、sangshen_024 這 7 對(duì)引物與原始序列比較差異小，基本重合，突變位點(diǎn)少，且測(cè)序雙峰穩(wěn)定。sangshen_06 與原始序列比對(duì)差異大，且測(cè)序峰值混亂，不穩(wěn)定。所以最后選定 sangshen_05、sangshen_07、sangshen_08、sangshen_09、sangshen_15、sangshen_23、sangshen_24 這 7 對(duì)引物進(jìn)行特異性驗(yàn)證。

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本文編號(hào)：2790456