【摘要】：絲素蛋白(Silk fibroin,SF)具有良好的物理機械性能、透氣透濕性、可降解性和生物相容性,在組織工程和生物醫(yī)用材料領域有潛在的應用。本文借助漆酶(Laccase)催化絲素蛋白接枝殼寡糖(COS),制備得到SF-g-COS膜材料;通過己糖激酶(Hexokinase)催化SF-g-COS膜材料中的COS磷酸化,結合仿生礦化在磷酸化膜材料表面沉積羥基磷灰石(HAp),制備絲素基仿生礦化材料,拓寬絲素基生物材料的應用范疇。研究首先選用絲素中酪氨酸的模型物對羥基苯乙酰胺(PHAD),考察了漆酶催化PHAD的自聚以及接枝COS的反應效果,借助超高效液相色譜串聯(lián)三重四極桿質譜(UPLC-TQD)、核磁共振氫譜(~1H-NMR)、傅立葉變換紅外光譜(FT-IR)分析產物結構。在此基礎上,通過體積排阻色譜(SEC)、凝膠電泳(SDS-PAGE)和粒徑分析漆酶催化絲素蛋白溶液接枝COS的交聯(lián)效果,對比膜材料的抗氧化性、抗菌性、熱性能和生物相容性。研究結果表明,漆酶可以催化PHAD形成自聚體,并與COS發(fā)生席夫堿和邁克爾加成反應;SDS-PAGE和SEC結果驗證了絲素蛋白溶液經(jīng)漆酶催化后,SF蛋白分子量增大,絲素蛋白分子間發(fā)生自交聯(lián)和接枝COS反應,制備得到的SF-g-COS膜材料具有較好的抗氧化性和抗菌性。在SF-g-COS膜材料制備基礎上,借助己糖激酶和三磷酸腺苷(ATP)催化COS磷酸化。采用高效液相色譜(HPLC)、基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF MS)和磷含量測試,探究酶促COS磷酸化的反應機制和作用效果。結果發(fā)現(xiàn),己糖激酶可以催化COS中C6位的羥基磷酸化,并伴隨著二磷酸腺苷(ADP)的生成;經(jīng)己糖激酶磷酸化的COS的FT-IR結果中出現(xiàn)P=O和C-O-P的伸縮振動;SF-g-COS膜材料經(jīng)過磷酸化處理后,磷含量明顯增加。將磷酸化SF-g-COS膜材料在Ca/P溶液中進行交替法仿生礦化,借助X射線衍射(XRD)、掃描電子顯微鏡(SEM)和表面能譜圖像(EDS-Mapping),分析了表面礦物相HAp的沉積效果,結果表明磷酸化處理改善了絲素膜材料的礦化效果,磷酸化的SF-g-COS膜表面形成更多HAp結晶相。此外,MG-63成骨細胞在上述絲素基仿生礦化材料表面具有較好的增殖和黏附效果,材料具有良好的生物相容性,在組織工程材料領域有潛在應用前景。
【學位授予單位】：江南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：TS102.33
【圖文】：

圖 1-1 漆酶催化酚類接枝氨基化合物的反應機理Fig.1-1 The Schematic illustration of the laccase-assisted grafting of amide on phenol1.3.2 己糖激酶的催化機理己糖激酶（Hexokinase）的催化機理是在 ATP 和 Mg2+的參與下，能夠將三磷酸腺苷（ATP）中的末位磷酸根轉移到六元糖的 6 位羥基上，同時伴隨著二磷酸腺苷（ADP）和 6-磷酸六元糖的生成[46]，其反應機理如圖 1-2 所示。

1.2.3 可以看出，在仿生礦化過程中，增加有機質表面陰離子基團的數(shù)目更加有利于 Ca2+的配位，從而生成更多的羥基磷灰石。1.5 本課題研究的目的、意義和內容1.5.1 研究的目的和意義絲素蛋白作為一種可生物降解的天然高分子，已廣泛應用于醫(yī)學材料、生物傳感器和日化產品加工等領域。采用生物酶法對絲素蛋白進行改性，不僅是一種安全環(huán)保的方法，而且能賦予絲素蛋白材料新的應用性能，具有很廣泛的應用前景。為此，如圖 1-3 所示，本課題借助漆酶催化 SF 蛋白與 COS 發(fā)生席夫堿和邁克爾加成反應，制備得到 SF-g-COS 復合材料；在此基礎上，通過己糖激酶催化 COS 的 C6 位羥基磷酸化，在絲素蛋白的表面引入陰離子磷酸根基團，提高對仿生礦化液中鈣離子的結合能力，即在后續(xù)交替仿生礦化，更能有效地誘導磷酸化 SF-g-COS 復合材料吸附鈣離子，通過鍵合和有序沉積將更多規(guī)整的羥基磷灰石晶體沉積在材料的表面上。通過上述研究，旨在以生物酶法替代傳統(tǒng)化學法，建立一種絲素基仿生礦化材料制備方法，拓展絲素蛋白在骨組織工程方面的應用。

圖 2-1 不同濃度 COS 的標準曲線Fig.2-1 The standard curve of different concentration of COSSC 分析和熱重法-微商熱重法（TG-DTG）用 DSC Q200 差示掃描量熱儀以 10°C /min 的升溫速度在 0-300°C 范圍內F 膜進行 DSC 分析。其中，樣品質量約 5.0 mg，氮氣流速 50.0 mL/min。用 TAQ500 熱重分析儀將礦化前后的 SF 膜進行 TG/DTG 分析，在石英坩質量約為 5.0 mg，測試的升溫范圍為 30-650°C，升溫速度為 10°C/min，mL/min。 抗氧化性能測試過 ABTS 法可評價通過不同處理后 SF 膜的抗氧化性能，其原理在于 AB作用下生成自由基 ABTS·+，如果樣品能夠使藍色的 ABTS·+還原成無色，有降低過氧自由基的的作用。通過測定反應前后吸光度的變化，可定量表氧化性的大小[29]。BTS·+陽離子自由基的制備是將 7 mM 的 ABTS 和 2.45 mM 的過硫酸鉀等

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本文編號：2776352