發(fā)布時(shí)間：2020-07-25 07:25

【摘要】：裸體方格星蟲(Sipunculus nudus L.)(以下全文簡(jiǎn)稱方格星蟲)主要分布在海南、廣西、廣東和福建沿海,是一種高蛋白、高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的水產(chǎn)品。目前,關(guān)于方格星蟲的活性研究主要包括抗氧化、抗菌、抗病毒、抗輻射、降血壓、改善學(xué)習(xí)記憶、抗疲勞和免疫調(diào)節(jié)等。在方格星蟲免疫活性研究方面,活性成分主要是多糖和粗提物,對(duì)于方格星蟲蛋白的免疫活性研究很少,因此方格星蟲免疫活性肽還有很大的研究空間。本文以方格星蟲為原料,對(duì)方格星蟲蛋白的理化特性進(jìn)行研究;通過pH調(diào)節(jié)法制備分離蛋白,研究分離蛋白的酶解工藝;通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證酶解產(chǎn)物各超濾組分的免疫活性;以體外免疫活性為評(píng)價(jià)指標(biāo)對(duì)超濾組分進(jìn)行活性追蹤,通過分離純化和質(zhì)譜鑒定確定免疫活性肽的氨基酸序列,皆在為開發(fā)方格星蟲高值化利用和免疫產(chǎn)品提供理論依據(jù)。主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:(1)方格星蟲是一種高蛋白低脂肪的水產(chǎn)品,蛋白含量和脂肪含量分別占原料干基的80.87%和2.37%。在方格星蟲蛋白組成中,水溶性蛋白、鹽溶性蛋白和不溶性蛋白分別占總蛋白的19.05%、43.58%和29.35%。SDS-PAGE電泳分析顯示,水溶性蛋白主要在6 kDa-200 kDa范圍內(nèi),鹽溶性蛋白主要在29-50 kDa和66-200 kDa范圍內(nèi),不溶性蛋白在48 kDa、102.3 kDa和200 kDa附近存在明顯條帶。方格星蟲組成蛋白氨基酸種類齊全,3種組成蛋白與免疫相關(guān)的堿性氨基酸和疏水氨基酸含量均超過總氨基酸的50%。DSC結(jié)果顯示,方格星蟲水溶性蛋白、鹽溶性蛋白和不溶性蛋白的變性溫度分別為77.9℃、69.2℃和54.9℃。(2)以小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖率為指標(biāo),通過酶篩選實(shí)驗(yàn)確定動(dòng)物蛋白酶和木瓜蛋白酶組成的復(fù)合酶(復(fù)合比例1:1)為實(shí)驗(yàn)用酶。通過單因素和響應(yīng)面優(yōu)化方格星蟲分離蛋白酶解實(shí)驗(yàn),確定最優(yōu)酶解條件為液料比(v/m)5:1、時(shí)間4.5 h、加酶量2460 U/g、溫度56℃在該條件下脾淋巴細(xì)胞的增殖率值為60.22%,與該模型預(yù)測(cè)值60.61%相近(p0.05)。(3)方格星蟲酶解產(chǎn)物經(jīng)過超濾分級(jí)得到2.5 kDa組分和2.5 kDa組分;體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明:2.5 kDa組分和2.5 KD組分分別在濃度為0.6 mg/mL和0.9mg/mL時(shí)免疫活性最好,并且2.5 kDa組分(0.6 mg/mL)的免疫活性高于2.5 kDa組分(0.9 mg/mL)(p0.05);體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明:方格星蟲2.5 kDa組分的3個(gè)劑量組均能夠增強(qiáng)小鼠細(xì)胞免疫功能、體液免疫功能、單核-巨噬細(xì)胞功能和NK細(xì)胞活性,通過《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》中增強(qiáng)免疫力功能檢驗(yàn)方法判定方格星蟲2.5 kDa組分有助于增強(qiáng)免疫力。(4)以體外免疫活性為評(píng)價(jià)指標(biāo)對(duì)2.5kDa組分進(jìn)行活性追蹤,利用Sephadex G-25凝膠層析和Symmetry C_(18)高效液相色譜進(jìn)行分離純化得到高活性組分F_(431),最終對(duì)F_(431)組分進(jìn)行質(zhì)譜分析,結(jié)果表明免疫活性肽的氨基酸序列為苯丙氨酸-賴氨酸(FK)或苯丙氨酸-谷氨酰胺(FQ)。
【學(xué)位授予單位】：廣東海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：TS254.1
【圖文】：

裸體方格星蟲活性肽的酶法制備及其免疫活性的研究。3 種方格星蟲組成蛋白的必需氨基酸含量稍有不同，其中水和不溶性蛋白分別為 30.55%、37.81%、33.71%是一種優(yōu)質(zhì)的中甘氨酸的含量最高（7.87%），鹽溶性和不溶性蛋白中含量為 15.65%、8.64%。方格星蟲因特有的鮮美備受人們的青睞成蛋白中呈味氨基酸占總氨基酸的 50%，因此方格星蟲的鮮關(guān)[78]。研究表明活性肽與氨基酸序列有密切關(guān)系，活性肽末水氨基酸時(shí)候，該活性肽的免疫活性較好[79]。方格星蟲的 酸和疏水性氨基酸占總氨基酸的 52.22%、54.11%和 52.18成蛋白中可能存在具有免疫活性的物質(zhì)。蟲蛋白質(zhì)組分分子量分布

22圖 3-3 各因素交互作用對(duì)脾淋巴細(xì)胞增殖能力的影響ig.3-3 The effect of the interaction of various factors on the proliferative capacity of splymphocyte由圖 3-3 可知 4 個(gè)因素的 6 個(gè)交互作用穩(wěn)定點(diǎn)均在實(shí)驗(yàn)范圍以內(nèi)，由加酶的交互作用圖形可知，曲面彎曲較大，等高線形狀接近橢圓[90]，因此加酶的交互作用優(yōu)于其他因素組分，此結(jié)論與表 3-5 中顯著性結(jié)果一致。Dert 對(duì)于實(shí)驗(yàn)的優(yōu)化結(jié)果為：液料比（v/m）5.22:1、時(shí)間 4.60 h、加酶量 24

裸體方格星蟲活性肽的酶法制備及其免疫活性的研究組分進(jìn)行下一步的質(zhì)譜分析。 質(zhì)譜分析質(zhì)譜分析是檢測(cè)多肽氨基酸序列的最常用方法之一。在檢測(cè)過程中，首先質(zhì)譜圖內(nèi)找到肽段的母離子才能進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜測(cè)定；在二級(jí)質(zhì)譜測(cè)定過程受到惰性氣體的碰撞分裂成不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的離子碎片；最后根據(jù)二級(jí)質(zhì)譜子推測(cè)氨基酸序列，二級(jí)質(zhì)譜中的碎片離子只要有衛(wèi)星離子、序列離子、離子、側(cè)鏈脫水離子和脫氨離子等[118]，因此可以從碎片離子的狀態(tài)推測(cè)多酸序列的信息，一般情況下，多肽的斷裂規(guī)律如圖 5-14 所示，由于多肽鏈很容易斷裂，所以更容易出現(xiàn) b 型和 y 型離子[119]。

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本文編號(hào)：2769509