【摘要】：意大利青霉(Penicillium italicum)是柑橘果實重要的采后病原真菌,引發(fā)柑橘業(yè)嚴重的采后損失。目前的防治方法主要是化學農(nóng)藥,存在環(huán)境污染和食品安全風險。深入了解意大利青霉致病作用機制,將有助于新型安全高效的防控技術開發(fā)。研究表明,碳源利用對于病原真菌的生長發(fā)育和毒力至關重要,碳代謝抑制(CCR)是碳源利用的關鍵機制,主要由核心轉錄因子CreA調(diào)控。本實驗研究了PiCreA在意大利青霉的生長發(fā)育、碳源利用和致病力中的作用。主要結果如下:1.從意大利青霉中克隆到一個編碼絲狀真菌CreA同源物的PicreA基因,其全長1236 bp,無內(nèi)含子。PiCreA蛋白由411個氨基酸組成,含有轉錄因子特定的兩個鋅指結構域,部分高度保守的CreA氨基酸序列,以及一些與調(diào)控相關的特殊結構域。PiCreA在意大利青霉中進行CCR調(diào)控,并在不同碳源條件下表現(xiàn)出不同的表達模式。2.利用根癌農(nóng)桿菌介導意大利青霉轉化獲得兩株PicreA敲除突變株。結果表明,PiCreA的缺失導致意大利青霉生長發(fā)育和營養(yǎng)利用能力減弱。在各種碳源培養(yǎng)基中,PiCreA敲除菌株表現(xiàn)出普遍30~50%的生長受損,但除孢子萌發(fā)推遲外,分生孢子、芽管及氣生菌絲均無明顯變化。在果膠誘導條件下,PiCreA敲除菌株中果膠酶基因表達被下調(diào)。意大利青霉接種柑橘果實,無論何種接種方式(孢子或菌絲),缺失PiCreA后意大利青霉的毒力幾乎完全喪失。3.利用RNA-seq技術,初步明確了PiCreA影響意大利青霉毒力的一些因素,包括?PicreA突變體可能誘導的植物抗性反應如次生代謝產(chǎn)物苯丙烷類物質(zhì)、萜類物質(zhì)轉錄上調(diào),茉莉酸、乙烯信號傳導途徑激活和活性氧爆發(fā)減少,以及?PicreA缺失可能影響意大利青霉能量代謝和侵染過程中細胞壁降解酶活性。這些結果表明,PiCreA不僅調(diào)控意大利青霉的碳代謝抑制機制,而且在營養(yǎng)利用,毒力等方面發(fā)揮重要作用。上述結果為研究意大利青霉的碳代謝途徑及進一步揭示意大利青霉與柑橘互作的分子機制奠定基礎。
【圖文】：

意大利青霉中碳代謝抑制相關轉錄因子 PiCreA 功能研究1.2.4.2 穿梭重組質(zhì)粒的構建利 用 Sac Ⅰ / BamH Ⅰ 限 制 性 內(nèi) 切 酶 分 別 對 敲 除 盒 片 段 和 穿 梭 質(zhì) 粒pCAMBIA3300 進行酶切，膠回收試劑盒純化回收后，利用 T4連接酶將重組片段與質(zhì)粒連接，并轉化大腸桿菌 DH5α 中，，培養(yǎng)于 LB 培養(yǎng)基（含有 50μg/mL 卡那霉素）。挑選并驗證長出的單菌落，驗證正確后測序。將正確的重組質(zhì)粒轉化根癌農(nóng)桿菌AGL1。載體構建示意圖見圖 2-1。

M. 2000 bp Marker；1. CreA2-F/R 擴增產(chǎn)物。Fig.2-1Amplification of degenerate primers CreA2-F/RM.2000bp Marker; 1.Amplification of CreA2-F/R..2 PicreA 基因的生物信息學分析2.1 PicreA 基因序列分析利用 DNAMAN 將 PicreA 基因序列拼接起來，結果顯示，PicreA 基因序A 開放閱讀框（open reading frame, ORF）為 1236 bp 長，并編碼一個 411的蛋白質(zhì)。將獲得的 PiCreA 氨基酸序列與其他四種真菌（Byssochctabilis、Penicillium polonicum、Talaromyces atroroseus、Helicocarpus griseusA 蛋白序列及 Saccharomyces cerevisiae 的 Mig1 蛋白序列進行比對，部分比圖 2-2 所示。
【學位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：TS255.1

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本文編號：2678350