【摘要】：食源性生物活性肽具有安全性高、易吸收、來源廣等多種優(yōu)點,越來越受到科研學者的關注。然而,受傳統(tǒng)分離純化技術效率限制,目前已報道的生物活性肽段序列很少,因此,發(fā)展一種可同時實現(xiàn)食源性蛋白水解物快速分離、活性肽段檢測和結(jié)構(gòu)鑒定的技術手段是目前亟需解決的問題。本文分別探討了肽分子在停流型二維液相色譜(2D-LC)中第一維凝膠色譜(SEC)和反相色譜(RPLC)的額外峰展寬情況,并對現(xiàn)有二維色譜峰檢測方法進行了一系列改善,在此基礎上,構(gòu)建了快速停流型SEC×RPLC-MS系統(tǒng)用于改善食源性蛋白水解物中肽段的分離和鑒定,與此同時,本文進一步構(gòu)建了停流型RPLC×SEC-MS/DPPH自由基清除活性分析系統(tǒng),用于食源性蛋白水解物中活性肽段的快速檢測和鑒定。本文主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:(1)構(gòu)建了一種常規(guī)全自動停流型SEC×RPLC二維液相色譜,并系統(tǒng)研究了停流操作對停流型2D-LC中第一維SEC分離的影響,結(jié)果表明:大分子蛋白質(zhì)或多肽在第一維SEC停流分析過程中的額外峰展寬極小,而小分子肽的額外峰展寬相對較大,但可通過調(diào)整其停流時間和分析溫度對其進行控制,此外,停流位置和停流次數(shù)對樣品在第一維SEC中的額外峰展寬影響極小。將該停流型SEC×RPLC應用于花生蛋白水解物的分離,獲得了明顯優(yōu)于單維液相色譜的分離效果,其全二維分離峰容量高達504。(2)在停流型SEC×RPLC的基礎上,將兩個維度的色譜柱互換并對閥切換結(jié)構(gòu)進行改良,進一步構(gòu)建了一種可用于蛋白水解物分子量分析的常規(guī)停流型RPLC×SEC二維液相色譜,并系統(tǒng)性研究了第一維RPLC的額外峰展寬情況,結(jié)果表明:分子量較大或保留時間較長的物質(zhì)在第一維RPLC中額外峰展寬均較小,僅有保留時間較短的小分子物質(zhì)存在較為嚴重的額外峰展寬。將該停流型RPLC×SEC用于食源性蛋白水解物的分離分析,發(fā)現(xiàn)第一維RPLC分離可大大降低第二維SEC的分離難度,改善其分離效果。與停流型SEC×RPLC相比,停流型RPLC×SEC的全二維分離速度較慢且峰容量較低(僅為200左右),但該系統(tǒng)可用于測定第一維RPLC全流出組分的分子量分布情況,同時,還可用于更準確地測定第一維RPLC特定流出組分的分子量。(3)基于原兩步檢測法,對二維液相色譜峰檢測方法進行了改良。在新方法中,引入了保留時間判定和雙向峰重疊判定,其中保留時間判定可根據(jù)第一維流出組分的不同采取不同的色譜峰偏移閾值,以適用于采用可變第二維液相色譜梯度的二維液相色譜峰檢測,而雙向峰重疊可支持設定峰寬對比高度,以減小峰拖尾對二維液相色譜峰檢測的影響。新方法在常規(guī)分離、第一維欠采樣和第二維采用可變梯度時所獲得的復雜二維液相色譜數(shù)據(jù)中均獲得了較好的檢測效果,正確檢測率均高于60%。與原Peters方法相比,新方法所得二維色譜峰檢測的正確率至少提高了6%。(4)對常規(guī)停流型SEC×RPLC的第二維液相色譜(~2D-LC)進行升級,構(gòu)建了一種基于常規(guī)離子源的快速停流型SEC×RPLC-MS系統(tǒng),并對其分離條件進行了優(yōu)化,應用于食源性蛋白水解物的肽組學分析。結(jié)果表明:超高效UPLC SEC與HSS T3柱可作為食源性蛋白水解物二維分離的較優(yōu)色譜柱對,結(jié)合進一步的進樣量、組分轉(zhuǎn)移體積及死體積優(yōu)化,該二維色譜分離效果大大改善,峰容量高達1165,體現(xiàn)了其對復雜樣品的強大分離能力。在玉米蛋白水解物的分離和鑒定試驗中,快速停流型SEC×RPLC-MS的PSMs(母離子二級譜匹配數(shù)量)較傳統(tǒng)1D-LC-MS提高了至少25%,MS2采集數(shù)量提高了至少兩倍。將該系統(tǒng)進一步應用于大豆肽及酪蛋白水解物的肽段分離和鑒定,實際峰檢測數(shù)量均超過200,PSMs鑒定量均超過9 k,而MS2采集量更是超過了50 k,充分展現(xiàn)了快速停流型SEC×RPLC-MS對食源性蛋白水解物的強大分離和鑒定能力。此外,通過將該鑒定結(jié)果與Biopep活性肽段數(shù)據(jù)庫進行對比,快速地發(fā)現(xiàn)了酪蛋白水解物中的6條已知活性肽段,同時發(fā)現(xiàn)了大量包含活性片段的潛在生物活性肽段。(5)在常規(guī)停流型RPLC×SEC的基礎上,對其停流型閥切換結(jié)構(gòu)進行進一步的改良,并對其~2D-LC進行升級,構(gòu)建了停流型RPLC×SEC-MS/DPPH自由基清除活性分析系統(tǒng)。通過探討反應環(huán)管路長短、DPPH·濃度、溫度及甲酸添加量對第二維SEC-DPPH自由基清除活性分析的影響,確定了第二維SEC-DPPH自由基清除活性分析的適宜條件為:反應環(huán)10 m、DPPH·濃度200μM、溫度40℃、甲酸添加量0.06%。通過谷胱甘肽標準品的停流型RPLC×SEC-MS/DPPH自由基清除活性分析,對該系統(tǒng)的有效性進行了充分驗證,在此基礎上,進一步將其應用于復雜混合標準品的分析,成功從復雜混標中鑒定到了具有強DPPH自由基清除活性的二肽GC和CW,并對上述兩種二肽進行了驗證,展示了該系統(tǒng)較強的創(chuàng)新性、有效性和實用性。
【圖文】：

圖 1-1 一種二維液相色譜的樣品環(huán)閥切換結(jié)構(gòu)示意圖-1 An advanced valve interface equipped with two sample loops comprehensive two-dimensional liquid chromatography柱接口切換接口結(jié)構(gòu)與樣品環(huán)結(jié)構(gòu)相類似，將圖 1-1 中兩個樣品環(huán)得到補集柱閥切換接口[75]。在二維分析過程中，，補集柱的主和再解析，相比于使用樣品環(huán)，補集柱可以實現(xiàn)更長時間的柱具備一定的溶質(zhì)濃縮效果，可使樣品組分中的溶質(zhì)“聚焦中的擴散，另外，補集柱的使用可同時有利于第一維組分的EC×RPLC 中的應用較多[76]。近年來隨著補集柱的不斷發(fā)展大，借助于補集柱的“濃縮和聚焦”作用，Wang 等人[10]利

2D-LC 的壓力波動，不利于檢測器的穩(wěn)定，其系統(tǒng)結(jié)構(gòu)亦進一步改進和完善。圖1-2 一種停流型二維液相色譜流路示意圖Figure 1-2 Schematic presentation of a stop-flow two-dimensional liquid chromatography1.4 二維液相色譜分離效果評價為了評價 2D-LC 的分離效果，國內(nèi)外科研學者發(fā)展了一系列評價方法，評價指標主要包括正交度、峰容量、實際峰檢測數(shù)量等，其中正交度主要用于衡量兩個維度之間液相色譜分離的獨立程度[89]；峰容量用于衡量該 2D-LC 系統(tǒng)在該分析條件下對該樣品的理論分離能力[90]；實際峰檢測數(shù)量[91]用于描述該 2D-LC 對樣品的實際分離情況。1.4.1 正交度2D-LC 的正交度主要用于衡量兩個維度之間色譜分離的相互獨立程度。為了實現(xiàn)更好的二維色譜分離效果，在當前 1D-LC 峰容量優(yōu)化至一定程度時，我們常希望在二
【學位授予單位】：華南理工大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：TS201.2;O657.72

【參考文獻】

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本文編號：2670571