【摘要】：本研究以大豆和黑豆為原材料。對(duì)于大豆,首先將大豆培養(yǎng)成愈傷懸浮培養(yǎng)物,同時(shí)制備大豆子葉組織,用褐藻酸寡糖(AOS)誘導(dǎo)愈傷懸浮培養(yǎng)物和子葉組織,UPLC-MS/MS確認(rèn)愈傷懸浮物和子葉合成大豆抗毒素(GLY)。通過(guò)比較不同濃度的AOS誘導(dǎo)兩種材料合成的GLY含量,篩選適合濃度的AOS并研究其誘導(dǎo)兩種材料合成大豆抗毒素的機(jī)制。開展低聚木糖(XOS)誘導(dǎo)黑豆合成GLY的響應(yīng)面優(yōu)化研究。研究獲得的結(jié)論如下:1、大豆愈傷組織以及愈傷懸浮物的培養(yǎng)方法研究。通過(guò)1%有效氯的次氯酸鈉溶液對(duì)大豆進(jìn)行滅菌前處理,培養(yǎng)出狀態(tài)優(yōu)良的大豆無(wú)菌苗。將無(wú)菌苗下胚軸轉(zhuǎn)移到添加有2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)和6-芐氨基嘌呤(6-BA)的MS固體培養(yǎng)基,誘導(dǎo)產(chǎn)生白色、堅(jiān)硬、致密的愈傷組織,其不適合培養(yǎng)愈傷懸浮物。下胚軸轉(zhuǎn)移到僅添加2,4-D的MS固體培養(yǎng)基,誘導(dǎo)產(chǎn)生淡黃色、柔軟、松散的愈傷組織。1.5 mg/L 2,4-D誘導(dǎo)下胚軸產(chǎn)生的愈傷鮮重最高,將愈傷組織轉(zhuǎn)移到1.5 mg/L2,4-D激素的液體MS培養(yǎng)基,獲得大豆愈傷懸浮培養(yǎng)物,為AOS提供誘導(dǎo)材料。2、褐藻酸寡糖誘導(dǎo)愈傷懸浮物和子葉合成GLY的機(jī)制研究。采用AOS分別對(duì)愈傷懸浮培養(yǎng)物和大豆子葉組織進(jìn)行外源誘導(dǎo)。通過(guò)硝酸銀誘導(dǎo)大豆獲得的大豆抗毒素對(duì)照品在高效液相色譜圖上的保留時(shí)間,確認(rèn)AOS誘導(dǎo)的愈傷懸浮培養(yǎng)物和子葉組織能夠合成GLY。2%AOS誘導(dǎo)的愈傷懸浮培養(yǎng)物產(chǎn)生的GLY量是誘導(dǎo)子葉產(chǎn)生的8.2倍,因此2%AOS可以研究愈傷懸浮培養(yǎng)物和子葉組織在GLY合成路徑中的代謝物含量和有關(guān)基因的調(diào)控變化,結(jié)果表明尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶(UGT)、3,9-二羥化紫檀堿6α-單加氧酶(CYP93A1)、glycinol 2-二甲基烯丙基轉(zhuǎn)移酶(G2DT)和glycinol 4-二甲基烯丙基轉(zhuǎn)移酶(G4DT)基因調(diào)控對(duì)GLY合成有關(guān)鍵作用。此外,對(duì)于GLYⅠ、Ⅱ、Ⅲ,異構(gòu)體Ⅰ在誘導(dǎo)的愈傷懸浮培養(yǎng)物中占最為顯著,而異構(gòu)體Ⅱ和Ⅲ在誘導(dǎo)的大豆子葉中是顯著的,解析了GLY在兩種材料中的合成機(jī)制。3、XOS誘導(dǎo)黑豆合成GLY的響應(yīng)面法優(yōu)化。在XOS誘導(dǎo)黑豆合成GLY的響應(yīng)面優(yōu)化研究中,三個(gè)因素對(duì)合成的GLY含量的影響順序是培養(yǎng)溫度誘導(dǎo)濃度誘導(dǎo)時(shí)間。擬合不同誘導(dǎo)條件下GLY實(shí)際含量得到二次多元回歸模型,相關(guān)系數(shù)為0.9254,表明模型能夠解釋92.54%的GLY實(shí)際值。獲得的GLY的優(yōu)化條件為誘導(dǎo)時(shí)間4.03 d、誘導(dǎo)濃度4.08%和培養(yǎng)溫度23.83℃,該條件下GLY含量為1.4118 mg/g干重。通過(guò)對(duì)GLY合成路徑中有關(guān)代謝物變化和基因調(diào)控的分析,本研究闡明相關(guān)基因?qū)Υx物的調(diào)控影響,同時(shí)UGT、CYP93A1、G2DT和G4DT基因?qū)LY合成量和異構(gòu)體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ比例起到?jīng)Q定作用。通過(guò)XOS對(duì)黑豆誘導(dǎo)產(chǎn)生的大豆抗毒素含量的響應(yīng)面優(yōu)化,提高了外源寡糖誘導(dǎo)子誘導(dǎo)豆類合成的GLY含量,為高效獲取GLY提供了基礎(chǔ)。
【圖文】：

glyceollin Ⅴ glyceollin Ⅵ glyceofuran圖 1-1 大豆抗毒素七種化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig. 1-1 Chemical structures of seven glyceollin compounds

大豆抗毒素Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的HPLC圖
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：TS214

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