發(fā)布時(shí)間：2020-05-09 17:26

【摘要】：生物胺(Biogenic amine,BA)是一類具有生物活性的低分子量含氮有機(jī)化合物的總稱,廣泛存在于富含蛋白質(zhì)和氨基酸的水產(chǎn)品中。大黃魚(Pseudosciaena crocea)作為我國重要的經(jīng)濟(jì)魚類之一,國內(nèi)市場需求量不斷增長,但由于其富含水分和多種可溶性蛋白,極易在貯藏、加工及流通過程中滋生微生物進(jìn)而分解魚體內(nèi)含氮物質(zhì)產(chǎn)生大量生物胺,導(dǎo)致產(chǎn)品腐敗,造成極大的經(jīng)濟(jì)損失、資源浪費(fèi)和環(huán)境污染。目前有關(guān)大黃魚中生物胺的產(chǎn)生特性及其消長機(jī)理尚未明確,因此本實(shí)驗(yàn)開展由特定腐敗微生物介導(dǎo)的冷藏大黃魚主要生物胺形成機(jī)制的探究和解析,旨在為有效進(jìn)行大黃魚品質(zhì)變化監(jiān)控和腐敗靶向抑制提供一定的理論基礎(chǔ)和保障。主要研究內(nèi)容包含以下四個(gè)方面:(1)本課題動(dòng)態(tài)檢測了養(yǎng)殖大黃魚冷藏過程中的生物胺含量、菌落總數(shù)、典型理化指標(biāo)(pH、TVB-N、TMA、P.I.%)及游離氨基酸含量變化,分析發(fā)現(xiàn)腐胺和尸胺是大黃魚的主要生物胺,且兩者含量之和可取代生物胺指標(biāo)(BAI = Put + Cad + Him + Tym)來更快更直接地評估大黃魚的新鮮度;我們進(jìn)一步通過構(gòu)建腐胺和尸胺與理化指標(biāo)的回歸模型(RPut = 0.88,P0.05;RCad = 0.87,P0.05)解析了兩者較強(qiáng)的致腐特性;而生物胺與其前體物質(zhì)游離氨基酸的動(dòng)態(tài)相關(guān)性分析初步預(yù)示了腐胺形成的相對復(fù)雜性。(2)本課題組前期鑒定得到大黃魚中致腐能力較強(qiáng)的特定腐敗菌S.baltica 73,基于前一章實(shí)驗(yàn)結(jié)果,本實(shí)驗(yàn)開展S.baltica 73中腐胺形成通路的探究。根據(jù)已有的腐胺代謝通路研究報(bào)道,經(jīng)過同源序列比對及PCR驗(yàn)證,我們在S.baltica 73中鑒定得到11個(gè)編碼腐胺通路代謝酶的基因,分別為ARG、ADC、AgDI、OCT、odc、speF、pptE、TF、TG、TH和PotI;進(jìn)而圍繞鳥氨酸脫羧酶這一關(guān)鍵限速酶所在的中心代謝通路(ODC體系),探究關(guān)鍵代謝物鳥氨酸和腐胺對該體系的誘導(dǎo)作用;并分別構(gòu)建了AspeF和△potE缺失株,結(jié)合基因表達(dá)量檢測和腐胺產(chǎn)量的動(dòng)態(tài)監(jiān)測,探究ODC體系的運(yùn)作機(jī)制,解析了speF和potE基因在腐胺產(chǎn)生中的關(guān)鍵主導(dǎo)作用,并提出了S.baltica 73中“PUT正向調(diào)控”的腐胺積累模式。(3)基于ODC體系探索環(huán)境pH對S.baltica 73腐胺積累的誘導(dǎo)調(diào)節(jié)作用。通過5個(gè)不同pH(5.5,6.0,6.5,7.0,7.5)培養(yǎng)環(huán)境刺激,我們探究了不同環(huán)境pH誘導(dǎo)對S.baLTICA 73 ODC體系相關(guān)基因表達(dá)、胞內(nèi)speF蛋白酶活性大小以及菌體產(chǎn)腐胺能力的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明pH為5.5、6.0、6.5的酸性環(huán)境對speF與potE基因具有較強(qiáng)的誘導(dǎo)表達(dá)作用并在6.0時(shí)最為顯著;5個(gè)不同培養(yǎng)條件下細(xì)胞內(nèi)speF蛋白酶活性大小依次為6.06.57.05.57.5;相應(yīng)的菌體產(chǎn)腐胺量分別為 536.74mg/L(pH = 5.5),679.16mg/L(pH = 6.0),604.25 mg/L(pH = 6.5),538.54 mg/L(pH = 7.0),340.91 mg/L(pH= 7.5);由此揭示了 S.balticA 73中弱酸環(huán)境(pH=6.0/6.5)誘導(dǎo)腐胺大量產(chǎn)生的機(jī)理。(4)從蛋白層面考慮,本實(shí)驗(yàn)利用親和免疫富集結(jié)合質(zhì)譜鑒定技術(shù),檢測了s.baltica73的乙�；揎椝�,鑒定到1103個(gè)乙酰化修飾蛋白和2929個(gè)乙�；稽c(diǎn);進(jìn)一步的生物信息學(xué)分析顯示乙酰化蛋白參與多種代謝通路,且搜尋驗(yàn)證了 ADC、OCT、speF這三個(gè)腐胺通路代謝酶都具有乙酰化修飾位點(diǎn),推測該修飾可能對腐胺產(chǎn)生及積累具有一定調(diào)節(jié)作用;通過構(gòu)建高保守性乙酰轉(zhuǎn)移酶和去乙�；傅幕蛉笔е�,我們初步探究了乙酰化修飾水平與腐胺產(chǎn)量的關(guān)系,對比結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)乙�；揎棌�(qiáng)度與腐胺含量存在一定負(fù)相關(guān)性。綜上所述,本課題研究結(jié)果表明冷藏大黃魚主要生物胺為腐胺和尸胺,兩者含量之和可評估魚體鮮度;且以大黃魚特定腐敗菌S.baltica73為切入點(diǎn),通過進(jìn)一步探究其腐胺形成機(jī)理,闡述了菌體內(nèi)“PUT正向調(diào)控”腐胺積累的運(yùn)作機(jī)制;同時(shí)也揭示并解析了弱酸性環(huán)境誘導(dǎo)S.baltica 73腐胺大量產(chǎn)生的作用機(jī)理;最后S.baltica 73乙�；揎椊M學(xué)的初探也表明了乙酰化修飾水平與腐胺積累程度潛在的負(fù)向關(guān)聯(lián)性。以上研究結(jié)果為水產(chǎn)品腐胺控制關(guān)鍵靶點(diǎn)的確定以及產(chǎn)品保鮮都提供了一定借鑒意義。
【圖文】：

于４°Ｃ下靜置６０１１！丨１１以去除脂肪及提取待測物質(zhì)，離心（ｉｎ，４°Ｃ）過濾，重復(fù)提取沉淀兩次，合并濾液并定容至５０ｍＬ。行高速離心（１３，０００Ｘｇ，１５ｍｉｎ，，４°Ｃ），上清液過０．２２ｎｍＰＶ動(dòng)氨基酸分析儀進(jìn)行檢測分析。逡逑曲線制備：氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)品用０．１邋ＭＨＣＬ配制成１００邋｜ｉＭ溶測分析。逡逑據(jù)處理與分析逡逑重復(fù)六次，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析用ＳＰＳＳ邋ｖ性分析、方差分析、顯著性分析及回歸分析，以Ｐ＜0．0５作為差采用Ｐｒｉｓｍ邋７．０繪畫軟件作圖。逡逑與分析逡逑殖大黃魚冷藏條件下ＴＶＣ變化情況逡逑

魚體ｐＨ會(huì)有略微下降，但隨著自身酶解作用以及微生物作用的加強(qiáng)，大量蛋白逡逑質(zhì)發(fā)生降解產(chǎn)生各類含氮揮發(fā)性物質(zhì)，致使ｐＨ逐漸上升。逡逑分析圖２－２知，揮發(fā)性鹽基氮在貯藏期間發(fā)生顯著變化，在貯藏末期己經(jīng)高逡逑達(dá)４０ｍｇ／１００ｇ。根據(jù)ＳＣ／Ｔ３１０１－２０１０《鮮大黃魚、凍大黃魚、鮮小黃魚、凍小黃逡逑魚》規(guī)定，大黃魚一級鮮度標(biāo)準(zhǔn)為ＴＶＢ－Ｎ邋￡邋１３邋ｍｇ／１００ｇ，二級標(biāo)準(zhǔn)為ＴＶＢ－Ｎ邋Ｓ逡逑３０ｍｇ／１００ｇ，由此可知冷藏大黃魚在第４天（ｌ３．１５ｍｇＭ００ｇ）己超出一級鮮度范逡逑圍，在１Ｃ藏丨２天（３０ｍｇ／１００ｇ）時(shí)超達(dá)二級標(biāo)準(zhǔn)，徹底腐敗變質(zhì)。同樣地，ＴＭＡ逡逑含量也在貯藏期間不斷顯著增加，從最初的１邋ｍｇ／１００ｇ到最后的１４２邋ｍｇ／１００ｇ，逡逑由此可見胺類物質(zhì)隨著貯藏時(shí)間的延長大量增多導(dǎo)致魚體腐敗，魚腥味也明顯增逡逑強(qiáng)。Ｐ．Ｉ．％為非蛋白氮在總氮中所占的百分比
【學(xué)位授予單位】：浙江工商大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：TS254.4

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本文編號：2656482