【摘要】：牛乳鐵蛋白肽(LFcinB,Bovine Lactoferricin)是酸性環(huán)境下,經(jīng)胃蛋白酶水解,從天然牛乳鐵蛋白(BLf,Bovine Lactoferrin)N末端釋放的一段含25個氨基酸殘基的陽離子肽,其氨基酸序列為:Phe-Lys-Cys-Arg-Arg-Trp-Gln-Trp-Arg-Met-Lys-Lys-Leu-Gly-Ala-Pro-Ser-Ile-Thr-Cys-Val-Arg-Arg-Ala-Phe。目前已經(jīng)證實LFcinB具有廣譜抗菌、抗腫瘤、抗病毒、抗寄生蟲和抗氧化等生物活性。此外,其良好的耐熱性和無抗原性有利于在食品工業(yè)的應用,尤其是嬰幼兒奶粉的生產(chǎn)。研究發(fā)現(xiàn)不同來源的乳鐵蛋白肽中,LFcinB的抗菌活性最高,因此,LFcinB及其衍生肽的研究成為近年來的研究熱點之一。巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)是一種高效的異源蛋白表達系統(tǒng),迄今為止,已有數(shù)百種異源蛋白在巴斯德畢赤酵母中成功表達。相對于其他表達系統(tǒng),巴斯德畢赤酵母可以對表達的異源蛋白進行翻譯后糖基化修飾和加工。其外泌型表達載體線性化后,整合入畢赤酵母基因組DNA中,可將目的蛋白分泌至發(fā)酵液中,簡化了下游純化工藝,降低生產(chǎn)成本。本文利用生物信息學工具,以LFcinB為模板,設計得到具有高抗菌活性的衍生肽序列。將衍生肽基因構建至表達載體,線性化后將衍生肽基因整合到巴斯德畢赤酵母基因組DNA中,通過基因工程菌外泌表達衍生肽。1、本文對LFcinB不同位點的氨基酸進行替換,設計得到5條衍生肽,利用生物信息學工具對衍生肽的理化參數(shù)、疏水殘基比例、電荷數(shù)、兩親性分布、二級結構及空間結構進行預測和對比分析,然后利用抗菌肽數(shù)據(jù)庫預測工具對衍生肽抗菌活性進行評價。得到一條最優(yōu)化衍生肽序列L3,其疏水性為52%,電荷數(shù)為+7,兩親性分布及空間結構模擬與LFcinB相似,綜合分析結果表明,衍生肽L3理論上具有比LFcinB更高的抗菌活性。2、將優(yōu)化設計的衍生肽基因克隆至擴增質(zhì)粒pUC-SP上,將pUC-SP-L3轉化至感受態(tài)大腸桿菌DH5α中,經(jīng)擴增后提取質(zhì)粒,用EcoR I和Not I進行雙酶切獲取L3目的基因;使用T4 DNA連接酶將目的基因連接至同樣經(jīng)EcoR I和Not I雙酶切的外泌型穿梭表達載體pPIC9K中,構建重組表達載體pPIC9K-L3;將重組表達載體pPIC9K-L3轉化至感受態(tài)大腸桿菌DH5α進行擴增,提取擴增后的重組表達載體,經(jīng)雙酶切、PCR擴增及基因測序驗證,證明衍生肽基因插入到經(jīng)酶切后的pPIC9K多克隆位點,且構建的重組表達載體pPIC9K-L3基因序列準確。3、使用限制性內(nèi)切酶Sac I將重組表達載體pPIC9K-L3線性化,電轉化至感受態(tài)畢赤酵母GS115細胞中,涂布至最小葡萄糖培養(yǎng)基(MD,Minimal Dextrose Medium)平板,于30℃恒溫靜置培養(yǎng)72 h;利用選擇性培養(yǎng)基最小甲醇培養(yǎng)基(MM,Minimal Methanol Medium)和MD平板篩選得到41個表型為His~+Mut~+,4個表型為His~+Mut~s的陽性轉化子;PCR擴增鑒定表明,目的基因已正確整合入GS115基因組DNA中。4、使用BMGY/BMMY培養(yǎng)基對得到的45個陽性轉化子進行篩選,設置甲醇濃度梯度為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%和3.0%,篩選得到5個具有抑菌活性的陽性轉化子,其中一個抑菌活性最強,甲醇誘導濃度為2.5%。5、使用500 mL錐形瓶對篩選得到最優(yōu)陽性轉化子進行搖瓶發(fā)酵,驗證并優(yōu)化其表達條件,抑菌實驗結果進一步確定,最佳甲醇誘導濃度為2.5%,最佳發(fā)酵時間為96 h;經(jīng)平行試驗對比分析,與天然LFcinB抑菌活性相比,衍生肽抗菌活性優(yōu)于LFcinB,證明了衍生肽分子設計的合理性;Tricine-SDS-PAGE檢測表明,衍生肽基因已得到了有效表達;將發(fā)酵上清液進行冷凍干燥,制備含有衍生肽成分的發(fā)酵上清液凍干粉。復水后抑菌實驗表明,10×濃縮液的抑菌圈直徑為同體積氨芐青霉素溶液(50 mg/mL)的2.5倍,證明濃縮液抑菌活性為氨芐青霉素的2.5倍。本研究基于抗菌肽結構-功能的關系,利用生物信息學工具設計LFcinB衍生肽,并對其抗菌活性進行了分析預測,實驗結果證明了衍生肽設計的合理性,衍生肽基因得到了有效的表達,研究結果為進一步擴大生產(chǎn)衍生肽奠定了理論基礎。
【圖文】：

cinB 一級結構：堿性氨基酸殘基用灰Fig1.1 The primary structures of LFcinB，LFcinB 第 1-13 位氨基酸殘基呈構，當其從 BLf 上釋放出來后，，在溶液中呈現(xiàn)為略微扭曲的反向間結構的轉變是其抗菌效力強于明，發(fā)生結構轉變時，Phe1、Cys3疏水面，位于 β-折疊的一側，其親水面，這種兩親性結構有利于結構的研究發(fā)展迅速，其結構-功 LFcinB 衍生肽。

.1 LFcinB 一級結構：堿性氨基酸殘基用灰Fig1.1 The primary structures of LFcin構子中，LFcinB 第 1-13 位氨基酸殘基疊結構，當其從 BLf 上釋放出來后，消失，在溶液中呈現(xiàn)為略微扭曲的反向B 空間結構的轉變是其抗菌效力強于構表明，發(fā)生結構轉變時，Phe1、Cys 形成疏水面，位于 β-折疊的一側，其形成親水面，，這種兩親性結構有利于 二級結構的研究發(fā)展迅速，其結構-功活性 LFcinB 衍生肽。
【學位授予單位】：江蘇大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：TS252.1

【參考文獻】

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1 李忠清;王亮;;抗菌肽牛乳鐵蛋白肽衍生肽在畢赤酵母中的表達及活性鑒定[J];生物技術通報;2011年06期

2 解庭波;;大腸桿菌表達系統(tǒng)的研究進展[J];長江大學學報(自科版)醫(yī)學卷;2008年03期

本文編號：2633146