【摘要】：苧麻等麻類纖維是優(yōu)良的紡織原料之一,但在應用前必須進行脫膠處理,以去除韌皮纖維中的果膠物質(zhì)并使纖維相互分離,賦予纖維優(yōu)良的紡織性能和品質(zhì)。與傳統(tǒng)的化學法脫膠相比,利用微生物生產(chǎn)的酶代替化學品降解膠質(zhì)復合物的酶法脫膠方法由于具有環(huán)境友好、對纖維損傷少等優(yōu)點,成為麻類脫膠技術發(fā)展的必然趨勢。實驗室前期篩選的Bacillius ssutilis 7-3-3所產(chǎn)的堿性果膠酶對苧麻具有良好的脫膠效果,通過培養(yǎng)基組成和發(fā)酵條件優(yōu)化、發(fā)酵過程調(diào)控、過表達果膠裂解酶PelA等措施,顯著提高了該菌株產(chǎn)聚半乳糖醛酸裂解酶(PGL)的能力。但由于麻纖維中的果膠質(zhì)具有復雜的組成和結(jié)構(gòu),它的降解需要一個復雜的酶系,在多種酶的共同作用下才能完成。為了進一步改良酶系,提高酶法脫膠效率,本論文在實驗室前期研究基礎上,研究了不同脫膠相關酶PelA、木聚糖酶(Xyn)和甘露聚糖酶(Man)等對苧麻的脫膠效果。論文首次實現(xiàn)了上述不同酶在B.suBtilis7-3-3中的同源共表達,同時提高了粗酶液中不同酶的活力,改善了菌株的酶系組成,顯著提高了苧麻的脫膠效果。此外,論文還對來自B.subtili 的鼠李半乳糖醛酸聚糖酶進行了表達并初步探討了其在苧麻脫膠中的作用。首先,利用穿梭質(zhì)粒PNW33N在B.subtilis 7-3-3中分別同源過表達了果膠裂解酶A(PelA),木聚糖酶(Xyn)和甘露聚糖酶(Man),使其相應的酶活力分別達到了 870U/mL、400U/mL和43U/mL,與出發(fā)菌株相比,分別提高了10倍、20倍和2倍。在此基礎上,通過更換甘露聚糖酶的啟動子進一步將甘露聚糖酶的活力提升了約40%,達到68 U/mL;通過串聯(lián)表達兩個果膠裂解酶A的基因片段,使其PGL酶活力達到1324 U/mL,與單片段過表達PelA菌株相比,酶活提高約30%。本論文研究了上述不同工程菌株粗酶液對苧麻纖維的脫膠效果,通過考核脫膠率、抗張強度、殘液中還原糖含量等指標,發(fā)現(xiàn)過表達PelA的工程菌株OE PelA的脫膠效果最佳,且脫膠后的纖維分散度高;但過表達木聚糖酶菌株OE Xyn和過表達甘露聚糖酶菌株OE Man與出發(fā)菌株B.subtilis 7-3-3相比,粗酶液的脫膠效果改善效果不大,說明相對而言,PelA在苧麻脫膠過程中的作用更為關鍵。其次,在B.subtilis 7-3-3中共過表達了Xyn和PelA。工程菌株OE PelA+Xyn發(fā)酵液中木聚糖酶和PGL的酶活力都獲得提高,脫膠實驗發(fā)現(xiàn)該工程菌株粗酶液的脫膠效果明顯優(yōu)于OEPelA的粗酶液,證明了PelA和木聚糖酶的共同作用有利于苧麻中果膠的降解脫除。進一步地,在B.subtilis 7-3-3中成功地共過表達了Xyn、Man和PelA三種酶組分,得到的工程菌株OE PXM的發(fā)酵液中果膠裂解酶、木聚糖酶和甘露聚糖酶的酶活力分別達到1028 U/mL、502 U/mL和25U/mL,與出發(fā)菌株B.subtilis 7-3-3相比,這三種酶的活力分別提高了 10倍、20倍和67%,使脫膠相關酶在整體分泌蛋白的占比增大,優(yōu)化了枯草芽孢桿菌的脫膠酶系組成。初步研究了共過表達菌株OEPXM粗酶液的酶學性質(zhì),發(fā)現(xiàn)果膠裂解酶、木聚糖酶和甘露聚糖酶的最適溫度分別為60℃、50℃和50℃,最適pH值分別是9.5、8.0和8.5。利用共表達菌株OE PXM的粗酶液對苧麻進行脫膠,結(jié)果顯示與其余單酶過表達菌株和OE PelA+Xyn等工程菌株相比,菌株OE PXM粗酶液的脫膠效果更優(yōu),且脫膠后纖維具有更高的強度,纖維也變得柔軟。掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn),經(jīng)OEPXM粗酶液脫膠后的苧麻纖維表面變得更光滑、纖維分散度更高;紅外分析表明,脫膠后苧麻的半纖維素的部分化學鍵發(fā)生斷裂,證明了半纖維素酶在脫膠中的作用。此外,從苧麻中提取膠質(zhì)復合物(包括半纖維素和果膠等組分)用于降解實驗,結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株OE PXM的粗酶液比單酶過表達菌株OEPelA、OEXyn、OEMan和出發(fā)菌株B.subtilis 7-3-3的粗酶液具有更高效的降解能力,證實了果膠裂解酶和半纖維素酶在脫膠中的共同作用。果膠結(jié)構(gòu)中存在著鼠李糖和半乳糖醛酸交替連接形成的主鏈,其在果膠中占有約35%的比例,推測鼠李半乳糖醛酸聚糖酶在果膠的降解中也可能發(fā)揮重要作用。前期在B.subtilis 7-3-3的基因組中分析得到一個鼠李半乳糖醛酸聚糖降解的基因簇,大小約為26 kbp,其中含有若干與鼠李半乳糖醛酸聚糖降解相關的蛋白基因。分別選取了4個基因片段,將其中無信號肽的基因片段3851、3856和3864分別表達在大腸桿菌中,帶有信號肽的3859片段表達在枯草芽孢桿菌中,分別得到了其目的蛋白。進而以不同脫膠酶系為基礎,添加上述不同蛋白進行脫膠實驗,初步研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)添加蛋白3851、3856和3864后,對苧麻的脫膠效果沒有明顯促進作用,而蛋白3859在枯草芽孢桿菌中的過表達則可以提高對苧麻的脫膠效果,為下一步菌株脫膠酶系的進一步優(yōu)化提供了參考。
【圖文】：

膠酶（ＰＰａｓｅ），，其將不溶性原果膠轉(zhuǎn)化為可溶性果膠（Ａｌｋｏｒｔａｅｔａｌ．，邋１９９８；Ｋａｓｈｙａｐ逡逑ｅｔａｌ．，邋２００１；邋Ｓｈａｒｍａｅｔａｌ．，２０１３；邋Ｇａｒｇｅｔａｌ．，２０１６；邋Ｈａｓｓａｎ＆Ａｌｉ，２０１６；邋Ｋａｚｕｈｉｓａｅｔ逡逑ａｌ．，２００１邋）。果膠酶的分類見圖１－２所示。逡逑果膠底物逡逑＾￣，邐Ｉ邐；逡逑Ｉ邋，邋Ｉ邋￣邋Ｉ邐，￣；），逡逑（邋原果膠邐（果膠酸邐＊半乳糖醛酸逡逑｜邋ＰＰａｓｅ逡逑果膠（可溶）邐｜邐Ｉ邐Ｉ邐Ｉ逡逑Ｉ邐￣￣ｒ－１￣￣＾邐消除邐水解邐水ｆ邐氙除逡逑■消Ｌ去甲１化“二〔—卜孔１以．２．２．６邋ｆＧ逡逑ｅｎｄａ－ＰＮＬ邐｜邋ＥＣ４．２邋２邋２邋｜ｅＣ４．２．２．９邐不飽和荽乳糖醒逡逑ｅｎｄ0邋ＰＭＧ邋ＥＣ４．２．２．１０不飽和半乳糖三半邐｜｜糖逡逑，，邐酵酸邐乳糖薛酸逡逑甲ＢＢ半乳糖＿逡逑ＰＭＥ邐ＰＡＥ逡逑ＥＣ邋３．１．１．１１邐ＥＣ３．１．１．６逡逑果膠酸＆甲醇果膠酸＆乙醇逡逑圖１－２果膠酶的分類逡逑Ｆｉｇ．邋１－２邋Ｔｈｅ邋ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆｐｅｃｔｉｎａｓｅ逡逑４逡逑

１．２．２．邋３鼠李半乳糖醛酸聚糖酶逡逑果膠的一級結(jié)構(gòu)由線性（同型半乳糖醛酸，ＨＧ）和分枝（鼠李糖半乳糖醛逡逑酸，ＲＧ）區(qū)域組成（圖１－３）。ＨＧ是ａ－１，４糖苷鍵連接的半乳糖醛酸（聚半乳逡逑糖醛酸）的線性均聚物，其中包含約７０％的半乳糖醛酸殘基。在分枝（毛狀）逡逑區(qū)域內(nèi)，可以發(fā)現(xiàn)兩種類型的多糖，ＲＧ－１和ＲＧ－ｎ。ＲＧ－１的主鏈具有含有半乳逡逑糖醛酸（ＧａｌＡ）和鼠李糖（Ｒｈａ）殘基的重復二糖單元，而ＲＧ－ＩＩ是含有ＨＧ骨逡逑架的支鏈肽結(jié)構(gòu)域，目前發(fā)現(xiàn)其側(cè)鏈上具有１１種不同類型的糖（ＨｅｎｋＡ，１９９５）。逡逑ＲＧＩ類型的多糖結(jié)構(gòu)占果膠總成分的３５％。有研宄表明，鼠李半乳糖醛酸聚糖逡逑酶是糖苷水解酶１０５家族，有糖苷水解酶功能，作用于二糖單元之間糖苷鍵逡逑（Ｔａｋａｆｉｉｍｉｅｔａｌ．，２００６）。因此推測在果膠的降解中，鼠李半乳糖醛酸酶必將發(fā)揮逡逑重要作用。目前己從許多真菌和細菌菌株中鑒定出了鼠李半乳糖醛酸酶
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：TS123

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本文編號：2622729