【摘要】：雞卵類黏蛋白(hen-egg ovomucoid,HOVM)是目前已知四種雞蛋卵清過敏原蛋白中致敏性最強(qiáng)的。該蛋白富含糖基,使其擁有較高的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、耐熱性、抗蛋白酶水解特性等,但糖基對其過敏原的影響研究較少。本研究采用苯酚-硫酸法確定糖苷酶酶解蛋白總糖含量,茚三酮法定量蛋白水解度,圓二色性光譜法表征蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu),熒光光譜法分析蛋白質(zhì)表面疏水性變化,間接酶聯(lián)免疫吸附法通過分析過敏原蛋白與IgG結(jié)合能力來表征其變應(yīng)原性的變化。首先探究了熱處理對于HOVM的結(jié)構(gòu)以及其與IgG結(jié)合能力的影響;然后利用四種特異性糖苷酶(β-半乳糖苷酶、β-甘露糖苷酶、β-N-乙酰氨基葡萄胺糖苷酶和肽-N-糖苷酶F)對HOVM的糖基進(jìn)行不同程度的消減得到脫糖基蛋白(deglycosylated hen-egg ovomucoid,dHOVM),并進(jìn)一步探究糖基對于蛋白酶法以及超高壓法處理HOVM變應(yīng)原性的影響,從而分析糖基對其結(jié)構(gòu)(包括二級結(jié)構(gòu)和表面疏水性)與變應(yīng)原性的影響,研究結(jié)果如下。首先,熱處理會影響HOVM的表面疏水性指數(shù)以及其與IgG結(jié)合能力:隨著熱處理強(qiáng)度(溫度和時間)的增加,HOVM與IgG的結(jié)合能力會下降,特別是90℃和100℃處理下,HOVM與IgG的結(jié)合能力顯著下降并在加熱110 min時達(dá)到最低值;同時,隨著熱處理強(qiáng)度的提高,表面疏水性指數(shù)會先顯示出上升的趨勢,然后再下降的趨勢。其次,糖基含量影響超高壓作用下的HOVM結(jié)構(gòu),從而影響其與IgG的結(jié)合能力。隨著糖基含量的減少,100~400 MPa范圍內(nèi)dHOVM二級結(jié)構(gòu)中β-折疊的含量降低,同時表面疏水性指數(shù)S_0及其與IgG的結(jié)合能力呈同趨勢改變,說明此時HOVM的三級結(jié)構(gòu)變化影響了與IgG的結(jié)合能力;500~800 MPa時,糖基含量對二級結(jié)構(gòu)的改變影響不大,其表面疏水性指數(shù)S_0及其與IgG的結(jié)合能力無一致性的變化規(guī)律,說明此時隨著壓力的增強(qiáng),HOVM的變應(yīng)原性改變已不再與三級結(jié)構(gòu)直接相關(guān)。并且,糖基含量會影響蛋白酶酶解HOVM的水解度,進(jìn)而影響其與IgG的結(jié)合能力。將糖苷酶消減作用后的dHOVM分別與三種蛋白酶(胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶)進(jìn)行酶解:隨著糖基含量的降低,對dHOVM的水解度會逐漸升高,且不同蛋白酶對dHOVM的水解作用強(qiáng)度從小到大依次為胰蛋白酶(水解度3.78%~5.09%)、木瓜蛋白酶(水解度6.63%~19.40%)和菠蘿蛋白酶(水解度7.36%~24.91%);反應(yīng)后的產(chǎn)物與IgG的結(jié)合能力發(fā)生改變:其中經(jīng)胰蛋白酶酶解后的HOVM與IgG結(jié)合能力降幅為1.8%~29.61%,木瓜蛋白酶酶解后其與IgG結(jié)合的能力降幅為37.35%~46.73%,菠蘿蛋白酶酶解后其與IgG結(jié)合的能力降幅為41.89%~47.06%;經(jīng)β-半乳糖苷酶脫糖基作用后(此時HOVM上糖基含量為15.21%)再經(jīng)菠蘿蛋白酶水解的產(chǎn)物與IgG結(jié)合能力最弱。
【圖文】：

圖 1-1 HOVM 的氨基酸殘基序列Fig. 1-1 Amino acid residual sequence of HOVM個肽序列殘基（-24~-1），圓圈表示成熟的蛋白質(zhì)序列。粗黑色線條（連接半鍵。波浪線表示完全糖基化位點，灰色虛線表示部分糖基化位點。

10圖 1-2 雞卵類黏蛋白中糖基結(jié)構(gòu)示意圖[90]Fig. 1-2 Structural diagram of HOVM sugar group 1-2 可知，圖（a）為 HOVM 三種糖基形式的共有結(jié)構(gòu)，據(jù)研究其約占整個糖蛋白分子的 14 %；和圖（c）為糖基（a）衍生的產(chǎn)物。究目的及意義課題采用四種專一性糖苷酶（β-半乳糖苷酶、β-甘露糖苷酶、β-N-乙酰苷酶和肽-N-糖苷酶 F）作用雞卵類黏蛋白（HOVM）糖基，通過比較 量與 HOVM 水解度推斷糖基在蛋白中起到的作用；對比脫糖基蛋白經(jīng)二級結(jié)構(gòu)組成含量、其表面疏水性和變應(yīng)原性的變化。分析糖基對其變，從而找到糖基對蛋白酶法與超高壓消減 HOVM 結(jié)構(gòu)與變應(yīng)原性的關(guān)對 HOVM 蛋白結(jié)構(gòu)與變應(yīng)原性的影響。為后續(xù)研究其致敏性的消減提。
【學(xué)位授予單位】：天津商業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：TS201.21

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本文編號：2618455