發(fā)布時間：2024-12-22 07:09

　　Nanog蛋白是維持胚胎干細胞自我更新和多能性的關鍵轉錄因子,特別是在腫瘤干細胞中,Nanog蛋白的表達與腫瘤的產生、發(fā)展和轉移密切相關。隨著對腫瘤干細胞基礎研究的深入,相關的醫(yī)學實驗及藥物研發(fā)生產對Nanog蛋白的需求也日益增多。目前體外生產Nanog蛋白的主要方式是利用微生物進行異源表達。已公開的報道主要是鼠源及豬源Nanog蛋白的原核表達,關于人源Nanog蛋白的原核表達研究報道較少且產量較低,不能滿足日益增長的市場需求。人源Nanog蛋白的高效制備可以有效解決動物源Nanog蛋白在臨床應用中引發(fā)的諸多不利因素,滿足科研及生產需求。因此,本研究利用分子克隆技術構建了重組枯草芽孢桿菌及重組大腸桿菌表達菌株,并且探究了重組菌株的發(fā)酵特性。主要研究結果包括:（1）人源nanog基因與穿梭質粒pMA5雙酶切后連接,構建成功的質粒轉入枯草芽孢桿菌WB800中實現胞內表達。質粒穩(wěn)定性檢測發(fā)現傳代96 h后攜帶重組質粒的菌落數下降至67%。培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件優(yōu)化后,Nanog蛋白產量達到189 mg·L^-1。（2）人源nanog基因與質粒pET-32a雙酶切后連接,構建好...

【文章頁數】：52 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖1-1Nanog蛋白與其他轉錄調控因子之間的相互作用

mu等[58]的研究表明采用TALEN和CRISPR/Cas9基因編輯技術敲除nanog基因具有抑制前列腺腫瘤細胞的生長、轉移，增加化療敏感度的作用，但是Nanog蛋白在腫瘤干細胞中具體的作用機理仍然難以捉摸。(3)研究Nanog蛋白與其他轉錄調控因子之間的相互作用機制，從而探究....

圖2-2蛋白濃度標準曲線

第二章材料與方法19第一階段溫度設定為37℃，重組菌在含有10g·L-1葡萄糖的培養(yǎng)基中擴增，通過葡萄糖定糖儀測定罐內葡萄糖殘余量，待其消耗盡后，通過流動加入甘油的方式補充碳源。第二階段在甘油補加3h后將溫度分別設定為37℃、30℃，30℃維持0.5h，在變溫后添加IPTG對重組....

圖3-1重組質粒雙酶切驗證

第三章結果與討論21第三章結果與討論3.1Nanog蛋白在重組枯草芽孢桿菌中的表達3.1.1枯草芽孢桿菌重組表達載體的構建PCR產物經純化試劑盒純化后，連接至克隆載體pMD19-TSimpleVector。連接后轉化至枯草芽孢桿菌WB800，挑取陽性轉化子，進行菌落PCR驗證，將....

圖3-2枯草芽孢桿菌中Nanog的SDS-PAGEFig.3-2SDS-PAGEofNanoginBacillussubtilis

江南大學碩士學位論文22的蛋白液沉淀中也無法檢測到相應大小的蛋白條帶，說明Nanog蛋白僅在重組枯草芽孢桿菌WB800/pMA5-nanog中實現了胞內表達。圖3-2枯草芽孢桿菌中Nanog的SDS-PAGEFig.3-2SDS-PAGEofNanoginBacillussubt....

本文編號：4019631