發(fā)布時間：2024-01-22 08:36

　　谷氨酸脫羧酶(GAD)與輔酶磷酸吡哆醛(PLP)結(jié)合,專一作用于L-谷氨酸或其鈉鹽的α-羧基,使其不可逆地脫去一分子CO₂得到γ-氨基丁酸(GABA)。GABA作為重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì),是一種價值極高的功能性氨基酸,以食品添加劑的形式廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)中。酶法制備GABA具有專一高效、不受資源和環(huán)境等因素的限制等優(yōu)點,逐步適用于工業(yè)化生產(chǎn)。本課題將來自大腸桿菌(Escherichia coli)的GAD在食品級宿主枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)中進行重組表達�？疾炝嗽谠撝亟M菌發(fā)酵培養(yǎng)基中添加輔酶PLP前體吡哆醛(PL)前后對重組GAD酶活力、溫度pH性質(zhì)的影響。進一步探究了在共表達GAD與磷酸吡哆醇氧化酶(PNPO)的重組菌發(fā)酵培養(yǎng)基中添加價格低廉的輔酶PLP前體吡哆醇(PN)時GAD的產(chǎn)酶情況及其溫度pH性質(zhì)。同時對利用全細胞制備GABA進行了工藝優(yōu)化。最后在此基礎(chǔ)上選擇性能較優(yōu)的菌株進行搖瓶和3-L罐發(fā)酵優(yōu)化,為后續(xù)在工業(yè)上大量制備食品級GABA打下堅實的基礎(chǔ)。主要研究成果有:(1)構(gòu)建含有E.coli GAD基因的重組菌B.subtili...

【文章頁數(shù)】：61 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 緒論
    1.1 γ-氨基丁酸(GABA)概述
        1.1.1 GABA的結(jié)構(gòu)與功能
        1.1.2 GABA的自然分布及制備工藝
    1.2 谷氨酸脫羧酶(GAD)的介紹
        1.2.1 GAD的理化性質(zhì)與來源
        1.2.2 GAD在微生物中的作用
    1.3 輔酶磷酸吡哆醛(PLP)生物合成途徑
        1.3.1 輔酶PLP前體及PLP的作用
        1.3.2 輔酶PLP合成途徑
        1.3.3 PLP補救合成途徑關(guān)鍵酶的活性調(diào)節(jié)
    1.4 枯草芽孢桿菌表達系統(tǒng)概述
        1.4.1 枯草芽孢桿菌分泌機制研究進展
        1.4.2 提高外源蛋白在枯草芽孢桿菌中表達水平的方法
    1.5 立題依據(jù)及意義
    1.6 本論文的研究內(nèi)容
第二章 材料與方法
    2.1 材料
        2.1.1 菌種與質(zhì)粒
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 主要儀器
        2.1.4 主要培養(yǎng)基
    2.2 谷氨酸脫羧酶(GAD)重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.2.1 目的基因gad B和表達載體p HY300PLK的引物設(shè)計和克隆
        2.2.2 目的基因gad B和表達載體p HY300PLK的連接
        2.2.3 感受態(tài)E.coli JM109 的熱擊轉(zhuǎn)化
        2.2.4 質(zhì)粒的提取與酶切驗證
        2.2.5 B.subtilis感受態(tài)細胞的制備
        2.2.6 B.subtilis感受態(tài)細胞的電擊轉(zhuǎn)化
    2.3 谷氨酸脫羧酶(GAD)和磷酸吡哆醇氧化酶(PNPO)共表達質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.3.1 基因組的提取
        2.3.2 引物設(shè)計
        2.3.3 表達載體和基因的連接
    2.4 發(fā)酵方法
        2.4.1 重組B.subtilis的搖瓶發(fā)酵
        2.4.2 重組B.subtilis的3-L罐發(fā)酵
    2.5 分析方法
        2.5.1 菌體濃度(OD600)的測定
        2.5.2 細胞干重的測定
        2.5.3 蛋白濃度的測定
        2.5.4 核酸瓊脂糖凝膠電泳分析
        2.5.5 聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析
        2.5.6 重組谷氨酸脫羧酶(GAD)酶活測定
        2.5.7 γ-氨基丁酸(GABA)的檢測方法
        2.5.8 重組谷氨酸脫羧酶(GAD)的溫度pH性質(zhì)
    2.6 重組GAD全細胞制備γ-氨基丁酸(GABA)工藝流程
        2.6.1 重組GAD全細胞的獲取
        2.6.2 細胞的預(yù)處理方式
        2.6.3 全細胞制備GABA流程
第三章 結(jié)果與討論
    3.1 E.coli谷氨酸脫羧酶在B.subtillis中的表達及溫度p H性質(zhì)研究
        3.1.1 重組菌B.subtilis/p HY300PLK-gad B的構(gòu)建
        3.1.2 重組菌B.subtilis/p HY300PLK-gad B的搖瓶發(fā)酵
        3.1.3 添加輔酶前體吡哆醛(PL)前后的重組GAD溫度p H性質(zhì)比較
    3.2 共表達PNPO對重組E.coli谷氨酸脫羧酶表達及溫度p H性質(zhì)的影響研究
        3.2.1 重組菌B.subtilis/p HY300PLK-gad B-Pdx H的構(gòu)建和重組表達
        3.2.2 重組菌B.subtilis/p HY300PLK-gad B-Pdx H的搖瓶發(fā)酵
        3.2.3 添加輔酶前體吡哆醇(PN)后的重組GAD溫度p H性質(zhì)研究
    3.3 重組菌全細胞轉(zhuǎn)化制備GABA的工藝優(yōu)化
        3.3.1 預(yù)處理對全細胞制備GABA的影響
        3.3.2 轉(zhuǎn)化溫度對全細胞制備GABA的影響
        3.3.3 轉(zhuǎn)化p H對全細胞制備GABA的影響
        3.3.4 加菌量對全細胞制備GABA的影響
        3.3.5 反應(yīng)時間對全細胞制備GABA的影響
        3.3.6 底物濃度對全細胞制備GABA的影響
    3.4 重組菌B.subtilis/p HY300PLK-gad B-Pdx H發(fā)酵條件優(yōu)化
        3.4.1 重組菌B.subtilis/p HY300PLK-gad B-Pdx H的搖瓶發(fā)酵優(yōu)化
        3.4.2 吡哆醇(PN)對重組菌B.subtilis/p HY300PLK-gad B-Pdx H3-L罐高密度發(fā)酵的影響
主要結(jié)論與展望
致謝
參考文獻
附錄 :作者在攻讀碩士學位期間發(fā)表的論文



本文編號：3882547