腈水合酶(Nitrile hydratase,簡稱NHase;EC:4.2.1.84)能夠催化腈在常溫中性條件下與水化合形成酰胺,是替代高溫強酸催化工藝實現(xiàn)酰胺類大宗化學品綠色制造的關(guān)鍵酶種。常見NHase是含?和?亞基的金屬酶,酶的成熟遵循亞基自身交換機制。但酶的熱穩(wěn)定性和有機溶劑耐受性較差,難以滿足工業(yè)化生產(chǎn)對酶學性質(zhì)的應(yīng)用要求。因此,亟需發(fā)掘新型NHase,改良酶的催化性能。本研究依據(jù)新發(fā)現(xiàn)的領(lǐng)鞭毛蟲(Monosiga brevicollis)單肽鏈腈水合酶的蛋白結(jié)構(gòu)特點,對惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida 5B/NRRL-18668)腈水合酶進行亞基融合重構(gòu),大幅提高腈水合酶的熱穩(wěn)定性和產(chǎn)物耐受性;又研究了來源于P.putida 5B和玫瑰色紅球菌(Rhodococcus rhodochrous J1)的腈水合酶亞基融合突變體的活化機理,揭示了調(diào)控蛋白對于融合型腈水合酶的激活機制。主要研究結(jié)果如下:(1)對P.putida 5B來源的腈水合酶PpNHase進行亞基融合重構(gòu),獲得了活性和穩(wěn)定性均大幅提高的亞基融合型腈水合酶。基于M.brevicollis單鏈腈水...

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【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 緒論
    1.1 腈類化合物
        1.1.1 腈類化合物的作用
        1.1.2 腈類的微生物轉(zhuǎn)化
    1.2 腈水合酶
        1.2.1 腈水合酶
        1.2.2 腈水合酶的催化機理
        1.2.3 腈水合酶的來源及基因結(jié)構(gòu)
    1.3 翻譯后修飾
        1.3.1 亞基自身交換
        1.3.2 金屬伴隨子
    1.4 腈水合酶的工業(yè)應(yīng)用
    1.5 腈水合酶的改造
        1.5.1 腈水合酶生產(chǎn)存在的問題
        1.5.2 大腸桿菌的異源表達
        1.5.3 腈水合酶穩(wěn)定性改造策略
    1.6 本文研究內(nèi)容
        1.6.1 立題依據(jù)及研究意義
        1.6.2 本文主要研究內(nèi)容
第二章 亞基融合型腈水合酶的構(gòu)建
    2.1 前言
    2.2 材料與方法
        2.2.1 菌株與載體
        2.2.2 實驗試劑
        2.2.3 實驗儀器
        2.2.4 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件
        2.2.5 基因操作
        2.2.6 蛋白表達及純化
        2.2.7 酶活測定
        2.2.8 鈷含量測定
        2.2.9 最適pH測定
        2.2.10 熱穩(wěn)定性測定
        2.2.11 產(chǎn)物耐受性測定
    2.3 結(jié)果與討論
        2.3.1 融合型腈水合酶的構(gòu)建及表達
        2.3.2 融合型腈水合酶的表征
        2.3.3 調(diào)控蛋白融合位置的影響
        2.3.4 融合型腈水合酶的理化性質(zhì)測定
    2.4 本章小結(jié)
第三章 融合型腈水合酶的熱穩(wěn)定性改造
    3.1 前言
    3.2 材料與方法
        3.2.1 菌株質(zhì)粒
        3.2.2 實驗儀器
        3.2.3 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件
        3.2.4 基因操作
        3.2.5 蛋白表達及純化
        3.2.6 酶活及動力學參數(shù)測定
        3.2.7 動力學及熱力學穩(wěn)定性測定
        3.2.8 同源建模
        3.2.9 計算模擬
    3.3 結(jié)果與討論
        3.3.1 融合型腈水合酶的同源建模
        3.3.2 融合型腈水合酶突變體庫的構(gòu)建
        3.3.3 突變體的篩選
        3.3.4 正向突變體的酶學表征
        3.3.5 正向突變體的結(jié)構(gòu)分析
        3.3.6 正向突變體分子間相互作用探究
    3.4 本章小結(jié)
第四章 融合型腈水合酶成熟機理探究
    4.1 前言
    4.2 材料與方法
        4.2.1 菌株與載體
        4.2.2 實驗儀器
        4.2.3 蛋白表達與純化
        4.2.4 腈水合酶的體外激活
        4.2.5 紫外-可見光掃描
        4.2.6 基于NanoLC-ESI-MS/MS的半胱氨酸氧化狀態(tài)測定
    4.3 結(jié)果與討論
        4.3.1 融合型腈水合酶的體外激活
        4.3.2 腈水合酶的紫外—可見光光譜掃描
        4.3.3 融合型腈水合酶活性中心的翻譯后修飾分析
        4.3.4 融合型腈水合酶成熟機理
    4.4 本章小結(jié)
第五章 調(diào)控蛋白的金屬伴隨子功能探究
    5.1 前言
    5.2 材料與方法
        5.2.1 菌株與載體
        5.2.2 實驗儀器
        5.2.3 質(zhì)粒構(gòu)建
        5.2.4 蛋白表達與純化
        5.2.5 酶活與動力學參數(shù)測定
        5.2.6 鈷離子的光譜掃描及含量測定
        5.2.7 鈷離子與調(diào)控蛋白的結(jié)合
        5.2.8 測定調(diào)控蛋白與腈水合酶的結(jié)合
        5.2.9 從頭建模及分子動力學模擬
    5.3 結(jié)果與討論
        5.3.1 調(diào)控蛋白對融合型腈水合酶活性的影響
        5.3.2 單獨調(diào)控蛋白的獲取
        5.3.3 單獨調(diào)控蛋白的表征
        5.3.4 單獨調(diào)控蛋白對融合型腈水合酶的體外激活
        5.3.5 異源調(diào)控蛋白對融合型腈水合酶的體內(nèi)激活
        5.3.6 鈷離子與調(diào)控蛋白體外結(jié)合的分析
        5.3.7 調(diào)控蛋白與脫輔基酶的結(jié)合分析
        5.3.8 調(diào)控蛋白模型的建立及動力學分析
        5.3.9 調(diào)控蛋白鈷離子結(jié)合位點的分析
        5.3.10 金屬伴隨子激活模型
    5.4 本章小結(jié)
第六章 天然融合型腈水合酶成熟機理探究
    6.1 前言
    6.2 材料與方法
        6.2.1 菌株與載體
        6.2.2 培養(yǎng)條件
        6.2.3 基因合成及密碼子優(yōu)化
        6.2.4 包涵體的檢測
        6.2.5 蛋白表達與純化
        6.2.6 酶活及熱穩(wěn)定性測定
    6.3 結(jié)果與討論
        6.3.1 M.brevicollis天然融合型腈水合酶的異源表達
        6.3.2 M.brevicollis天然融合型腈水合酶的表達優(yōu)化
        6.3.3 M.brevicollis天然融合型腈水合酶的活性及熱穩(wěn)定性
        6.3.4 異源調(diào)控蛋白對M.brevicollis天然融合型腈水合酶的激活
    6.4 本章小結(jié)
主要結(jié)論與展望
    主要結(jié)論
    展望
論文創(chuàng)新點
致謝
參考文獻
附錄 ：作者在攻讀博士期間發(fā)表的論文



本文編號：3847062