膠原蛋白作為細胞外基質中重要的結構蛋白,是人體中含量最多的蛋白質,占人體干重的30%,不僅為細胞提供了生理環(huán)境,維持生命體組織形態(tài),還參與影響細胞粘附、增殖、遷移以及信號傳導等生化活動,具有促進組織或器官的修復及再生等生物學功能。但由于動物組織提取膠原蛋白存在動物源疾病風險,限制了動物源提取膠原蛋白的應用。近年來,一種來源于化膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)的的三螺旋結構類膠原蛋白引起了科學家們的興趣,但由于這種原核來源的Scl2膠原蛋白缺乏與哺乳動物細胞結合的功能位點,在改造之前并不具有生物學功能,故本研究意在通過替換和插入的方式給Scl2重組膠原蛋白增加功能位點,并探索其在生物材料領域的應用。首先本文從分子層面上展開了對Scl2重組膠原蛋白骨架上功能位點的改造,通過PCR引物設計將不同數(shù)量的RGD(Arg-Gly-Asp)序列以定點突變的方式引入Scl2膠原蛋白骨架上。再采用同源重組的方式將天然Ⅰ型膠原蛋白與整合素的結合位點(GFPGER)取代Scl2骨架中對應的氨基酸序列,從而獲得兩組不同整合素位點功能化的Scl2膠原蛋白。并通過SDS-PAGE驗證了各目...

【文章頁數(shù)】：84 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
致謝
摘要
Abstract
第一章 緒論
    1.1 細胞外基質
        1.1.1 基膜
        1.1.2 細胞基質黏附
    1.2 膠原蛋白的研究進展
        1.2.1 膠原蛋白的種類及結構特征
        1.2.2 膠原蛋白的生物合成
        1.2.3 類膠原蛋白的研究進展
        1.2.4 類膠原蛋白的重組表達
    1.3 重組膠原蛋白Scl2的研究進展
        1.3.1 Scl2膠原蛋白的結構解析
        1.3.2 Scl2膠原蛋白的工業(yè)化潛能
        1.3.4 Scl2膠原蛋白骨架的功能位點改造
        1.3.5 Scl2膠原蛋白融合表達小分子多肽的應用
        1.3.6 Scl2膠原蛋白在組織工程應用領域的開發(fā)
    1.4 整合素家族
        1.4.1 整合素的結構及分類
        1.4.2 整合素的激活機制
        1.4.3 整合素結合配體
        1.4.5 RGD在組織工程中的應用
        1.4.6 RGD靶向抗腫瘤藥物研究
    1.5 本論文研究思路和主要內容
第二章 實驗材料與方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 菌株及質粒
        2.1.2 主要試劑、工具酶及試劑盒
        2.1.3 培養(yǎng)基及緩沖液
        2.1.4 實驗試劑的配制
    2.2 實驗儀器
    2.3 實驗及分析方法
        2.3.1 分子克隆實驗
        2.3.2 感受態(tài)細胞轉化
        2.3.3 SDS-PAGE電泳
        2.3.4 蛋白樣品脫鹽
第三章 重組膠原蛋白Scl2功能位點改造
    3.1 前言
    3.2 材料與方法
        3.2.1 質粒與菌株
        3.2.2 工具酶及主要試劑
        3.2.3 培養(yǎng)基和緩沖液
        3.2.4 分子生物學基本操作
        3.2.5 引物設計與合成
        3.2.6 RGD系列位點引入
        3.2.7 GFPGER位點引入
        3.2.8 重組Scl2系列膠原蛋白的表達
    3.3 結果與討論
        3.3.1 RGD系列位點引入
        3.3.2 GFPGER位點引入
        3.3.3 Scl2系列蛋白在大腸桿菌中的表達
    3.4 本章小結
第四章 SCL2系列蛋白高效純化方法建立
    4.1 前言
    4.2 實驗材料
        4.2.1 質粒與菌株
        4.2.2 工具酶及主要試劑
        4.2.3 緩沖液及反應試劑
    4.3 實驗方法
        4.3.1 Ni²⁺柱親和層析
        4.3.2 酸法沉降
        4.3.3 木瓜蛋白酶法水解
        4.3.4 胃蛋白酶水解
        4.3.5 蛋白質脫鹽與濃縮
        4.3.6 蛋白質的保存
    4.4 結果與討論
        4.4.1 Ni²⁺柱親和層析
        4.4.2 酸法沉降
        4.4.3 蛋白酶水解
    4.5 本章小結
第五章 SCL2膠原蛋白活性測試
    5.1 前言
    5.2 實驗材料
        5.2.1 細胞與黏附分子
        5.2.2 實驗試劑及設備
    5.3 實驗方法
        5.3.1 蛋白濃度測定
        5.3.2 細胞培養(yǎng)
        5.3.3 細胞懸滴培養(yǎng)
        5.3.4 黏附實驗
    5.4 結果與討論
        5.4.1 蛋白定量濃度測定
        5.4.2 MiaPcCa-2細胞懸滴培養(yǎng)
        5.4.3 PSC細胞懸滴分散效果
        5.4.4 L929細胞黏附效果
        5.4.5 HUVEC細胞黏附效果
    5.5 本章小結
第六章 總結與展望
    6.1 總結
    6.2 展望
參考文獻



本文編號：3741102